Optımızatıon of polymer conjugatıon for ınterleukın-1 receptor antagonıst: Effıcıency, resolutıon, and functıonal assessment

Bu tez, IL-1 reseptör antagonisti (IL-1Ra) için PEGilasyon stratejilerini yapı temelli ve kontrollü bir karşılaştırma çerçevesinde ele almaktadır. IL-1Ra üzerindeki erişilebilir rezidüler haritalanarak, tiyol-seçici (maleimid) ve lizine yönelik (NHS) konjugasyon yaklaşımları, aynı 5, 10 ve 20 kDa PEG basamakları boyunca düşük stokiyometri koşullarında karşılaştırılmış; ardından tercih edilen yöntem için ayrıntılı bir stokiyometri taraması yürütülmüştür. Klinik diziden yalnızca tek amino asit farklılığı içeren bir IL-1Ra varyantı (M143V) üretilmiş, 15N ile işaretlenmiş ve HSQC NMR analizleri için kullanılmıştır; böylece PEGilasyonun yapısal bütünlük üzerindeki etkisi incelenmiş ve klinikte kullanılan rekombinant IL-1Ra (anakinra) ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. 5, 10 ve 20 kDa koşullarında tiyol-hedefli yöntem, homojen ve yüksek verimle PEGile edilmiş ürünler verirken; lizin hedefli yöntem farklı PEGilasyon derecelerinde konjugatlar içeren heterojen karışımlar oluşturmuştur. Başlangıçta kullanılan düşük stokiyometri oranının ardından, tiyol konjugat verimini artırmak amacıyla PEG:protein oranı yükseltilmiş; ancak bu artış, hedef konjügat ürün miktarını arttırmamış ve konjügatların kromatografik ayrılabilirliğini azaltmıştır. Bu tablo, düşük stokiyometri aralığında 10 kDa mPEG-maleimid kullanımının rasyonel bir başlangıç seçimi olduğunu göstermiştir. M143V varyantı, Anakinra ile karşılaştırılabilir biyolojik aktivite sergilemiş olup, ilgili 1H–15N HSQC spektrumu doğal IL-1Ra proteinine benzer katlanmanın korunduğunu doğrulamıştır. Yine M143V üzerinde gerçekleştirilen 10 kDa tiyol–PEG konjugatının 1H–15N HSQC spektrumunda ise PEGilasyon kaynaklı beklenen yerel kimyasal kayma değişimleri gözlemlenmiş, fakat genel katlanmasının korunduğu görülmüştür. Hücre temelli deneyler, PEGilasyonun maksimum inhibisyonu koruduğunu, ancak doz–yanıt eğrisini daha yüksek konsantrasyonlara kaydırdığını göstermiştir. Bütün olarak bu çalışma, IL-1Ra konjügat çalışmaları için, tekrarlanabilir bir analitik–yapısal–fonksiyonel model ile kimya × boyut × stokiyometri parametrelerini doğrudan karşılaştıran bir tasarım sunmaktadır.