İnsan naif pluripotent kök hücrelerinin genetik ve epigenetik düzenleyicilerinin araştırılması

Pluripotent kök hücreler, naif veya primed (meyilli) olarak adlandırılan iki temel hücresel durumda bulunabilirler. Naif pluripotent kök hücreler, geleneksel hazır durumlarla karşılaştırıldığında gelişimsel yetenek açısından üstün bir konuma sahiptirler. Ancak insan naif pluripotent kök hücrelerinin üretilmesi ve korunması zorlu bir süreçtir. Bu nedenle, naif hücreleri izole etmek ve ilişkilendirilen genetik ve epigenetik düzenleyicileri açığa çıkarmak için araçlar geliştirmek önemlidir. Amacımız, heterojen kültürlerden naif hücreleri izole etmek için bir haberci oluşturmak, naif indüksiyon protokollerini optimize etmek ve naif durum kazanımının düzenleyicilerini ortaya çıkarmaktı. İfade verilerine dayanarak, naif pluripotent kök hücrelerde özellikle ifade edilen bir gen olan KLF17'yi seçtik. Bu nedenle, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinde (iPSCs) KLF17-T2A-EGFP floresan bir haberci oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme kullanarak bir KLF17-T2A-EGFP floresan habercisini oluşturduk. Bu GFP tabanlı haberci sistemini naif dönüşüm adımları sırasında test ettik. EGFP ifadesinin kantitatif PCR analizi, naif özgü aktivasyonu gösterdi ve bu da raporun başarılı bir şekilde oluşturulduğunu gösterdi. Naif kök hücrelerin dönüşümünü optimize etmek devam eden bir zorluktur. KLF17 ve NANOG/LIN28A'nın naif indüksiyon üzerindeki etkilerini test ettik. Kantitatif PCR sonuçları, bu transkripsiyon faktörlerinin kontrollere göre naif belirteçlerin aktivasyonunu artırdığını gösterdi, bu da onların sıfırlamayı hızlandırabileceğini düşündürdü. Ayrıca, KLF17 ve NANOG aşırı ifadesinin somatik hücrelerden hem primed hem de naif yeniden programlamada etkilerini değerlendirmeyi amaçladık. Sonuçlar, KLF17 aşırı ifadesinin yeniden programlama verimini etkilemediğini gösterdi. Ancak NANOG aşırı ifadesi hem primed hem de naif yeniden programlamanın verimini artırdı. Ayrıca, naif ve primed yeniden programlama üzerinde KLF5, KLF17 ve LIN28A transkripsiyon faktörlerinin nakavt etkilerini araştırdık. KLF5 nakavtı her iki programlamayı da etkilemedi. Ancak KLF17 nakavtı özellikle naif yeniden programlamanın verimini azalttı, primed yeniden programlamayı etkilemedi. Bunun aksine, LIN28A nakavtı hem primed hem de naif yeniden programlamanın verimini azalttı. Son olarak, epigenetik düzenleyicilerin küçük molekül inhibitörlerini primed ve naif yeniden programlama üzerinde test ettik. İCBP112, İBRD9, RN1, A83-01 ve EPZ5676 inhibitörleri hem primed hem de naif koşullar altında yeniden programlama verimini önemli ölçüde artırdı. Tüm bu sonuçlar, somatik hücrelerden primed ve naif kimlik kazanımını etkileyen hem transkripsiyon faktörlerinin hem de epigenetik düzenleyicilerin rolünü göstermektedir.