CREBBP/EP300 ve BRD9'un somatik hücrelerin pluripotensiye yeniden programlamasındaki rollerinin araştırılması

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörünün; OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC (OSKM) anlatımıyla, uyarılmış pluripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlanabilir. Somatik hücrelerin kimliğini muhafaza eden epigenetik yolaklar, somatik hücrelerin yeniden programlamasına engeldir. Bu tarz yolakların kimyasal veya genetik inhibisyonu yeniden programlama verimini arttırmaktadır. Bu tezde, üç kromatin faktörünün; CREBBP, EP300 ve BRD9'un yeniden programlamaya etkisini kimyasal ve genetik işlev kaybı deneyleriyle araştırdım. Tezin ilk bölümde, spesifik inhibitörlerle CREBBP/EP300'ün bromodomain'inin yeniden programlamaya engel olma fonksiyonunu araştırdım. RNA-dizileme, CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonunun fibroblastlarda çok ifade edilen genlerin anlatımını azalttığını göstermiştir. Ancak, CREBBP/EP300'ün A485 kimyasalıyla asetiltransferaz aktivitesi inhibe edilince pluripotensi genlerinin anlatımı düşerek yeniden programlama verimi azalmıştır. Transpozaz erişebilir kromatin analizi sonrası dizileme (ATAC-dizileme), H3K4me1 ve H3K27ac kromatin immün-çöktürme sonrası dizileme (ChIP-dizileme) sonuçları H3K27ac seviyesinin, erişilebilir kromatin ve olası enhancer (arttırıcı) bölgelerinde CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonuyla azaldığını göstermiştir. Buna ek olarak, CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonuyla anlatımı azalan transkripsiyon faktörlerinden biri olan PRRX1'in devamlı anlatımının uPKH oluşumunu pluripotensiyle alakalı genlerin anlatımını baskılayarak engellediğini fonksiyonel olarak gösterdim. Bu sonuçlar CREBBP/EP300'ün asetillenmiş lizinlerle etkileşiminin, somatik hücrelerin kimliğini muhafaza ettiğini ortaya çıkarmıştır. Tezimin ikinci bölümünde, yeniden programlamayı düzenleyen faktörleri bulmak için CRISPR-Cas9 aracılığıyla SWI/SNF komplekslerine odaklanmış bir tarama yaptım. Bu tarama, kanonik olmayan ncBAF kompleksinin spesifik elemanlarından BRD9 ve GLTSCR1'in yeniden programlamaya engel olduklarını buldu. Buna ek olarak, üç farklı BRD9 bromodomain inhibitörünün ve BRD9 yıkıcısının yeniden programlama verimini arttırdığını, sadece OCT4 ve SOX2 anlatımıyla uPKH oluşumunu sağladığını gösterdim. BRD9 nakavt uPKH'lar pluripotensi belirteçlerini üretmesi, kısa süreli BRD9 inhibisyonunun hücre bölünmesi ve OCT4 pozitif hücre sayısını azaltmaması BRD9'un pluripotensi oluşumu ve devamlılığında vazgeçilebilir olduğuna işaret etmektedir. Ancak, BRD9 kaybı ve inhibisyonu, uPKH'ların mezoderme farklılaşmasını azaltmıştır. Fibroblastlarda RNA-dizilemesi yapılmış ve sonuçlar BRD9 inhibisyonunun bu hücrelerde anlatımı fazla olan genleri baskıladığını göstermiştir. ATAC-dizilemesi, erişebilir kromatinin promotör yerine olası aktif enhancer (arttırıcı) bölgelerinde BRD9 inhibisyonuyla azaldığını göstermiştir. Buna ek olarak, BRD9 inhibisyonuyla anlatımı azalan transkripsiyon faktörlerinden ZBTB38 ve MN1'in anlatımını arttırmak yeniden programlama verimini azaltmıştır. Bu sonuçlar, BRD9 ve ncBAF kompleksinin enhancer'lar aracılığıyla somatik hücrelerin kimlikleri muhafaza ettiğine işaret etmektedir. Bu tezde sunulan bulgular, somatik hücre kimliğini muhafaza eden kromatin faktörlerinin yeniden programlamaya engel olduğunu ve bu tarz faktörlerin inhibisyonunun düşük verimli uPKH oluşumunu arttırmakta kullanılabileceği gösterilmiştir.