SIK2 proteininin Raf-1 proteini araciliğiyla FGF2 sinyal yönetimindeki görevi & SIK2 proteininin Erk proteini tarafindan fosforlanma motiflerinin belirlenmesi için mutant üretimi

Müller hücreleri çoğalımı Ras/MAPK yolağı üzerinden FGF2 sinyaliyle hızlı ve kısa süreli ERK1/2 aktivasyonuyla indüklenmektedir. Bir serin/treonin kinaz olan tuzla indüklenebilir kinaz 2 (SIK2), bu çerçevede yeni bir düzenleyicidir. Laboratuvar sonuçlarımız göstermiştir ki, SIK2 yolak üyesi Gab1'i Ser266 üzerinden fosforile ederek FGF2 sinyal iletimini baskılamada görev almaktadır. Ayrıca SIK2 bir diğer yolak üyesi olan Raf-1`i Ser621 üzerinden fosforile etmektedir. Bu araştırmada, Raf-1'in SIK2 tarafından fosforilasyonunun Raf-1 ve aşağı yönlü elemanlarının aktivitesi üzerinde negatif etkisi bulunduğunu öne sürülmektedir. Bunun analizi için, FGF2 ile uyarılmış kontrol ve SIK2 susturulmuş Müller hücrelerinde Raf-1 `in Ser621 üzerindeki 0 ile 120 dakika arasındaki zaman diliminde fosforilasyon düzeni incelenmiştir. Ayrıca, Raf-1 aktivitesi, Raf-1 substratı olarak kinaz inaktif MEK kullanılarak in vitro kinaz tayini ile analiz edilmiştir. Verilerimiz önermektedir ki, FGF2 uyarımının 10. dakikasında Raf-1'in SIK2 tarafından Ser 621 üzerindeki fosforilasyonu en yüksek seviyedeyken; 60. dakikada en düşük seviyededir. SIK2'nin susturulmuş olduğu hücrelerde Raf-1 aktivitesi 10. dakikada en yüksek seviyededir ve 60. dakikada bazal düzeye yakındır. Bu veriler SIK2'nin aktivasyon profili ile uyumludur. Bu durumda, 10. dakikada en yüksek aktivite seviyesine ulaşan SIK2'nin Raf-1 aktivitesini Ser621'i fosforile ederek baskıladığı sonucuna varılabilir. Raf-1 fosforilasyon durumu ve aktivitesi SIK2'nin en düşük aktivite düzeyinde olduğu 60. dakikada bazal düzeye yaklaşmaktadır. Araştırmanın ikinci kısmında, SIK2 mutantları oluşturularak, ERK tarafından SIK2'nin fosforilasyonu araştırılmıştır. Önceki verilerimize göre; ERK SIK2'yi FxFP motifine birleşik (S/T)P (DED domain) olan ERK fosforilasyon motifine dayanarak belirlenen 758 ve 863 numaralı 2 aday treonin üzerinden fosforile etmektedir. Bu fosforilasyon SIK2'nin aktivasyonu ve modülasyonu ile sonuçlanmaktadır. Hedef amino asitlerin belirlenmesinde ilk adım olarak, T863A SIK2 mutantı üretilmiştir.