In vitro
333 theses under this subject heading
Doku mühendisliği ve biyosensör uygulamaları için nanogözenekli anodize alüminyum oksit membranların fiziksel ve kimyasal özelliklerinin incelenmesi
Anodik alüminyum oksit (AAO) membranlar biyomedikal mühendisliğinin birçok uygulama alanında fiziksel ve kimyasal avantajları nedeniyle ön plana çıkan seramik bir malzeme grubudur. Bu tez kapsamında, AAO membranlar doku mühendisliği ve biyosensör uygulamaları açısından ele alınmıştır. Tezin ilk kısmında AAO membranların nöroelektrot olma potansiyelleri araştırılmıştır. Sonuçlar, iletken 100 nm AAO (CAAO) membranların sinir gelişimini, farklılaşmasını iletken 250 nm AAO membranlara nazaran tetiklediğini göstermiştir. Dahası, 100 nm AAO membranlar, membranlardaki sinir büyüme faktörlerinin kontrollü salım parametreleri kontrol edilirse nöron elektrot yüzeyi olma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, membranlar Alzheimer proteinlerinin tespiti için faydalanılan Raman aktif polikarbonat filmlerin üretiminde kalıp olarak kullanılmıştır. Çalışmalar 20 nm Au kaplanmış multi çatal desenli substratların (Au@MDS) 0,5 pg/ml konsantrasyonuna kadar amiloid β 1-42 (Aβ 1-42) proteininin tespitine olanak sağladığını göstermiştir. Ayrıca yüzeylerin sinyal tekrarlanabilirliği (% RSD: %17), seçiciliği (miyoglobin) test edilmiştir. Sonuçlar Au@MDS`lerin fiziksel yapıları nedeniyle sıcak nokta oluşumunu tetiklediğini göstermiştir. Ek olarak, damla yayma tekniği kullanılarak üretilen kitosan:jelatin (K:J) nanodesenli ve/veya epidermal büyüme faktörü katkılanmış filmler üretilmiş ve bu filmlerin implant kaplama ve yara örtü modeli (melanogenez perspektifinde) olarak potansiyelleri in vitro/in vivo koşullarda takip edilmiştir. Kemik doku mühendisiliği ile ilgili yapılan çalışmalar nano K:J filmlerin mezenkimal kök hücreleri düz K:J filmlere ve TCPS yüzeylere nazaran kemik hücrelerine farklılaştırma potansiyeli tespit edilmiştir. Ayrıca benzer analizler olgun kemik hücreleri için tekrarlanmış ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. Deri doku mühendisliği çalışmaları in vitro ve in vivo koşullarda yapılan protein ve gen temelli testleri ile sunulmuştur. Epidermal büyüme faktörü (EGF), melanogenezde önemli bir etkiye sahip olmamasına rağmen, yaranın kapanma performansını arttırdığı gösterilmiştir. Sonuçlar histoloji boyamaları ile doğrulanmıştır. Ancak, nanotopografik etkinin melanogenezde aktif rol aldığı tespit edilmiştir. Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, nano filmlerin EGF varlığında iyi bir yara yama modeli olabileceği düşünülmektedir. Sonuçlar, AAO mebranların kontrol edilebilir parametrelerinin doğrudan ya da dolaylı (kalıp) olarak hücresel aktiviteyi ve optik sensörlerde sıcak nokta oluşumunu tetikleyici bir potansiyele sahip olduğunu göstermiştir.
Meme kanseri dokusundan elde edilen tümör infiltran lenfosit (TIL)'lerin in vitro ortamda çoğaltılması ve fenotiplerinin saptanması
Bu çalışma Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Merkezi'nde metastazik olmayan, erken evre meme kanseri teşhisi konmuş hastalardan alınmış olan tümör dokusu üzerinde tümör infiltran lenfositlerin (TIL) in vitro ortamda IL-2 ile çoğaltılıp, flow sitometri testi ile immünofenotipik özelliklerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Bu amaca ulaşabilmek için öncelikle Genel Cerrahi Bölümü tarafından alınan tümör taşıyan meme, mastektomi sonrası Patoloji Birimi'ne getirilir. Patolog tarafından tespit edilen tümörden alınan 2-3 mm çapında bir parça mekanik parçalama sonrasında, T hücre artışına neden olan bir sitokin olan rekombinant IL-2 ile besiyerinde kültüre edilmiştir. Tümörün çalışıldığı ilk günü takip eden 7. ve 14. günlerde tümörden genişleyen TIL'lerin genişleme oranı flow sitometrik yöntemlerle incelenmiştir. Sonuç olarak yapılan bu çalışma ile adoptif T hücre tedavisinin meme kanserli hastalarda ileriye yönelik bir immünoterapi yöntemi olarak kullanılabilirliği araştırılmıştır.
Korunga yem bitkisinde tohum kökenli Alternaria alternata'nın uçucu yağlar ile mücadele olanaklarının araştırılması
Bu çalışmada, korunga yem bitkisinde tohum çürüklüğü hastalığına neden olan Alternaria alternata (Fr.) Keissl.'ya karşı, kekik (Thymus vulgaris), okaliptus ( Eucaliptus globulus), defne (Laurus nobilis), mersin (Myrtus communis) ve adaçayı (Salvia officinalis) uçucu yağlarının in vitro koşullarda antifungal aktiviteleri araştırılmıştır. Bu amaçla in vitro koşullarda 1 μl/petri, 10 μl/petri, 50 μl/petri dozları uygulamaya alınmıştır. Uçucu yağlar otomatik mikro pipetlerle steril kültür antibiyogram disk kâğıtlarına damlatılmıştır. Parafilm ile kapatılan petri kapları 22±2 °C' de 8 gün boyunca inkübe edilmiştir İnkübasyon süresi tamamlandıktan sonra ölçümler yapılmış ve misel gelişiminin engellenmesi yüzde olarak belirlenmiştir. Bu araştırma sonunda, uçucu yağlardan kekik, okaliptus, defne mersin ve adaçayı 50 μl/petri dozlarında A. alternata 'ya karşı sırasıyla %100, %94,21, %84,92 %80,64 ve %43,46 oranında antifungal etki göstermişlerdir. Denemeye alınan tüm uçucu yağlarda 1 μl/petri, 10 μl/petri dozları arasında fungal patojenin baskı altına alınması yönünden herhangi bir fark olmadığı gözlemlenmiştir. Uçucu yağlardan kekik, okaliptus, mersin, defne ve adaçayı 1 μl/petri, 10 μl/petri dozlarında A. alternata 'ya karşı sırasıyla %99.80, %63.57, %58.78, %56.78 ve %37.68 oranlarında antifungal etki göstermişlerdir. Bu araştırmada doğaya dost uçucu yağlar ile in vivo çalışmalara ışık tutabilecek veriler elde edilmiştir.
Covıd-19 tedavisinde kullanılan ilaçların insan böbrek hücre hattı üzerine etkilerinin in vitro değerlendirilmesi
COVID-19 olarak adlandırılan ve 2019 yılı itibari ile tüm dünyayı etkileyen SARS-CoV-2"ye karşı özgül bir tedavinin bulunmaması, hali hazırda başka hastalıkların tedavisinde kullanılan bazı ilaçların kullanılmasını gündeme getirmiştir. Bu ilaçlardan hidroksiklorokin (HCQ), favipiravir (FVP) ve valproik asit (VPA) pandemi sırasında sıklıkla ve yüksek dozlarda reçete edilmiştir. Bu Yüksek Lisans Tez çalışmasında HEK293T hücrelerinde HCQ, FVP ve VPA uygulanmalarının hücre canlılığı, çoğalması ve morfolojisi üzerine etkileri MTT analizi ve AO/PI boyamaları kullanılarak, HDAC aktivitesindeki değişim ve bu değişimin anti-inflamatuar yanıt belirteçleri olan IL-6, IL-10 ve TNF-α ifadesine etkisi ELİSA yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. VPA, HCQ ve FVP uygulanan kültürlerde hücre canlılığının devam ettiği herhangi bir hücre ölümü olmadığı gözlenmiştir. Yapılan MTT analizleri sonucunda VPA uygulanan kültürlerde hücre proliferasyonunun 24. ve 48. saatte ve HCQ uygulanan kültürlerde 48. saatte azaldığı, FVP uygulanan kültürlerde ise 24. saatte hücre proliferasyonunun azaldığı fakat 48. saatte tekrar artmış olduğu gözlenmiştir. Tüm deney gruplarında HDAC aktivitesinin artmış olduğu belirlenmiştir. VPA uygulanan kültürlerde 24. saatte %20,42 ve 48. saatte %5,77, HCQ uygulanan kültürlerde 24. saatte % 53,16 ve 48. saate %54,43 ve FVP uygulanan kültürlerde 24. saatte %164,22 ve 48. saatte % 198,16 artış gerçekleşmiştir. HCQ IL-10 ifadesinde artışa, FVP IL-10 ve IL-6 seviyesinde artışa ve VPA uygulaması özellikle TNF-α ifadesinde artışa neden olmuştur. Sonuç olarak HDAC aktivitesindeki artışın IL-10, IL-6 ve TNF-α değişimlerine neden olduğu, VPA uygulamasının TNF-α üzerindeki etkisinin HDAC ile ilişkili olabileceği ancak IL-10 ve IL-6 ifadesinden bağımsız farklı bir hücresel yolak ile ilişkili olabileceği gösterilmiş ve literatürde henüz yer almayan önemli bulgular raporlanmıştır.
Melazma tedavisinde yeni yaklaşımlar ve olası toksik etkilerinin In Vitro olarak değerlendirilmesi
Melazma, melanin pigmentini üreten melanositlerin sayısının ve aktivitesinin artmasına bağlı olarak özellikle de yüz gibi vücudun güneş ışınlarına daha fazla maruz kaldığı bölgelerdeki epidermis tabakasında ve/veya dermis tabakasında kahverengi veya gri-kahverengi melanin pigmentinin birikimiyle sonuçlanan, kronik, edinilmiş bir hastalıktır. Melazmanın etiyolojisinde genetik yatkınlık, UV ışınlarına maruziyet, oral kontraseptifler, gebelik, tiroit fonksiyon bozuklukları, kozmetikler, fotoduyarlılığa neden olan ilaçlar gibi çok sayıda faktör rol oynamakla birlikte kesin nedeni bilinmemektedir. Melazma tedavisi etiyolojisinin çok faktörlü olması nedeniyle zor ve karmaşıktır. Topikal olarak uygulanan tedavi seçenekleri geçici olarak iyileşmeyi sağlayabilir; ancak, hastalık çoğunlukla nüks eder. Tedavide sıklıkla tercih edilen hidrokinonun ciddi yan etkilerinin olabileceği bilindiğinden son yıllarda toksisitesi düşük, etkinliği yüksek ilaçların melazma tedavisinde kullanılması için araştırmalar yapılmaktadır. Farklı hastalıkların tedavilerinde kullanılan metformin ve askorbik asidin "ilaç yeniden konumlandırması" ile farklı alanlarda da kullanılabileceği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Yeni tedavi seçenekleri arasında olabileceği düşünülen metforminin, siklik adenozin monofosfat (cAMP) üzerinden melanin sentezinde rol oynayan genlerin ekspresyonunu inhibe edebileceği, bu sayede de melanositlerdeki melanin miktarının azalmasını sağlayabileceği düşünülmektedir. Askorbik asidin tirozinaz enziminin yapısındaki bakır iyonu ile etkileşerek tirozinaz aktivitesini inhibe ettiği bildirilmiştir. Bu tez kapsamında MNT-1 insan melanoma hücre hattında askorbik asit, metformin ve askorbik asit+metformin kombinasyonunun melanin oluşumu, cAMP oluşumu, L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) düzeyleri, tirozinaz gen ekspresyonu ve düzeyleri, sitotoksisite ve oksidatif stres üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Sitotoksik olmayan konsantrasyonlarda uygulanan askorbik asidin ölçülen parametreleri anlamlı bir şekilde değiştirmediği belirlenmiştir. Metforminin ise, hücre içi reaktif oksijen türevleri (reactive oxygen species, ROS) düzeylerini ve tirozinaz düzeylerini anlamlı derecede arttırdığı görülmüştür. Kombine uygulama ile ise, hücre içi ROS düzeyleri ve tirozinaz düzeyleri anlamlı derecede yükselmiştir. Özellikle tirozinaz düzeyleri ve gen ekspresyonu dikkate alındığında, kombine uygulamanın melazma tedavisinde yararlı olamayacağı; askorbik asidin veya metforminin tek tek uygulamalarının ise sınırlı fayda sağlayabileceği söylenebilir. Ancak, bu konuda yapılacak kapsamlı in vivo çalışmalara gereksinim vardır.
Rasajilin içeren ağızda dağılan tablet formülasyonlarının geliştirilmesi, in vitro ve in vivo değerlendirilmesi
Parkinson hastalığı, çoğunlukla motor hareketlerin, konuşmanın ve diğer fonksiyonların zayıfladığı, sinir sisteminin nörodejeneratif bir hastalığıdır. MAO-B enziminin dopamin metabolizmasında rolü nedeniyle, MAO-B inhibitörleri parkinson hastaları için önemli terapötik gelişmelerdir. Selejiline göre etkili ve daha selektif MAO-B inhibitörü olan rasajilin mesilatın ticari bir ODT formu mevcut değildir. Bu tez kapsamında, parkinson hastalığının tedavisinde kullanılmak üzere rasajilin içeren ağızda dağılan tablet formülasyonları geliştirilmesi amaçlanmıştır. Farklı dağıtıcı/süperdağıtıcı içeren plasebo ODT tabletleri geliştirilerek toz ve tablet kontrollerinden elde edilen sonuçlar doğrultusunda optimum ODT formülasyonu belirlenmiştir. Optimum ODT formülüne rasajilin eklendikten sonra toz ve tablet kontolleri yapılmıştır. Ayrıca rasajilinin intestinal permeabilitesini tayin etmek için Caco-2 hücreleri ve intestinal perfüzyonu yapılmıştır. Rasajilinin hepatik disposizyonu in situ karaciğer perfüzyonu yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Optimum ODT formülasyonun (ODT-9R) dağılma süresi 10,671,04 sn olarak tayin edilmiştir. İçerelik tekdüzeliği %1014,8'dır. Çözünme hızı çalışmaları üç farklı ortamda (distile su, 0,1N HCl, pH 6,8 fosfat tamponu) gerçekleştirilmiş ve ilk 5 dakikada rasajilinin yaklaşık %100'ü çözünmüştür. ODT-9R formülasyonunun Caco2 hücre hattında permeabilitesi (5,624x10-57,88x10-6 cm/sn) eksipiyanların etkisiyle anlamlı derecede artmıştır (p<0,05). ODT-9R formülasyonunun intestinal permeabilite değerleri (3,73x10-4 , 5,89x10-4 , ve 3,27x10-4 cm/sn) jejunum, ileum ve kolonda artış göstermiştir. Eritrosit ve Evans mavisi ile karşılaştırıldığında, rasajilin karaciğerde daha geniş bir alana dağılmış, hepatik ekstraksiyonu 0,404 ± 0,060, hepatik klerensi ise 0,101±0,015 mL/sn olarak tayin edilmiştir. Tez çalışmalarından elde edilen bulgular doğrultusunda hedeflenen amaca uygun bir rasajilin ODT formülasyonu geliştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Ağızda dağılan tablet, Bağırsak perfüzyonu, Caco-2, Karaciğer perfüzyonu, Rasajilin
Aflatoksin M1 biyoerişilebilirliği üzerine probiyotik mikroorganizmalar, biyopolimer ve diyet lifi etkinliğinin incelenmesi
Aflatoksin M1 (AFM1) süt ve süt ürünlerinde en sık bulunan mutajenik ve karsinojenik özelliklere sahip önemli bir mikotoksindir. Bu çalışmada probiyotik olarak Leuconostoc mesenteroides RSKK 06043, Saccharomyces cerevisiae RSKK 08022, prebiyotik olarak inülin ve biyopolimer olarak kitosanın sütte AFM1 bağlama kapasitesi ve in vitro sindirim modeli uygulaması ile AFM1 biyoerişilebilirliği üzerine etkisi incelenmiştir. Oluşturulan çalışma gruplarında (pozitif ve negatif kontrol, AFM1+ S. cerevisiae, AFM1+ L. mesenteroides, AFM1+S. cerevisiae+ L. mesenteroides, AFM1+inülin, AFM1+kitosan, AFM1+S. cerevisiae+L. mesentorides+inülin, AFM1+S. cerevisiae+L. mesentorides+ kitosan) bulunan serbest AFM1 miktarı inkübasyon sonrası, in vitro sindirim modeli uygulamasında ince bağırsak ve kolon sonrasında HPLC ile belirlenmiştir. İnkübasyon sonrası AFM1 bağlanma düzeyi %26,7-50,9 arasında bulunmuştur. En yüksek AFM1 bağlama düzeyini S. cerevisiae; en düşük kitosan göstermiştir. Ancak gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık elde edilmemiştir (p>0,05). İn vitro sindirim modeli uygulamasında AFM1'in sütte biyoerişilebilirliği ince bağırsak sonrasında %90,35±1,15; kolon sonrasında %81,40±0,00 bulunmuştur. S. cerevisiae bulunan ve L. mesenteroides+S. cerevisiae+Kitosan bulunan örneklerde ince bağırsak sonrası AFM1 biyoerişilebilirliğinde önemli derecede düşüklük saptanmıştır (sırasıyla %29,30±2,29; %54,68±6,79; p<0,001). Diğer örneklerde ise %68,37-88,72 arasında tespit edilmiştir (p>0,05). Kolon sonrası S. cerevisiae bulunan ve inülin bulunan örneklerde AFM1 biyoerişilebilirliği kontrol grubuna göre anlamlı olmayan artış göstermiştir (sırasıyla %91,16±4,60 ve %96,05±2,23; p>0,05). Diğer örneklerde ise AFM1 biyoerişilebilirliği %51,55-60,23 arasında anlamlı düzeyde düşmüştür (p<0,001). Bu çalışmada S. cerevisiae, L. mesenteroides, inülin ve kitosanın sütte AFM1 bağlanma kapasiteleri gösterilmiş ve L. mesenteroides ve kitosanın en kararlı biyolojik ajan olduğu belirlenmiştir. Ayrıca kitosan ve probiyotik bakteriler, süt ürünlerinde aflatoksinlerin biyoerişilebilirliğini azaltmak için güvenilir biyolojik ajan olarak kullanılabilirler.
Migren tedavisinde kullanılmak üzere geliştirilen hibrit nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo etkinliklerinin değerlendirilmesi
Bu tez çalışmasında migren tedavisi için intranazal yol ile uygulanmak üzere; RZT yüklü CGRP(8-37) ile konjuge edilmiş PLGA nanopartiküllerinin geliştirilmesi, in vitro karakterizasyon ve hücre kültürü deneylerinin yapılarak in vivo fare modelinde beyne ulaşan RZT miktarının tespiti, metabolik analizler ve optogenetik yöntem ile oluşturulmuş kortikal yayılan depresyon migren modeli üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. PLGA polimerine CGRP (8-37) peptit konjugasyonu gerçekleştirilmiş ve bu konjugat kullanılarak sonuç nanopartikül formülasyonları uygun şekilde elde edilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarında, konjugasyon ile nanopartiküllerin reseptöre afinitesinin arttığı bulunmuştur. Ayrıca formülasyonların in vivo deneylerde kullanılacakları konsantrasyonlarda sitotoksik olmadığı gösterilmiştir. İntranazal ve intraperitoneal uygulanması sonucu, formülasyonların RZT çözelti grubuna göre beyinde daha yüksek oranda RZT taşınmasını sağladığı ve konjugasyon yapılmış/hedeflendirilmiş nanopartikül formülasyonları ile beyinde daha yüksek oranda RZT taşınmasının gerçekleştiği tespit edilmiştir. Metabolomik çalışmalarda intranazal ve intraperitoneal formülasyon uygulamasından sonra beyinde bazı metabolit düzeylerinde değişiklik olduğu bulunmuştur. İn vivo fare migren modeli ile konjugasyon yapılmış/hedeflendirilmiş formülasyonlarının etkin olduğu gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Migren, Rizatriptan, CGRP(8-37), PLGA, Nanopartikül Temelli İlaç Taşıyıcı Sistemler Destekleyen Kurum: Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK); Öğrenci doktora eğitimi süresince TÜBİTAK 2244 (118C131) programında bursiyer olarak görev almıştır. Ayrıca in vivo deneyleri, TÜBİTAK 2214 (1059B142100088) bursundan faydalanarak ABD'de yürütmüştür.
Development of anticancer drug loaded nanoparticle and in-vitro evaluation
Colorectal cancer is the third most commonly occurring cancer which remains asymptomatic in its early stages, leading to 1.8 million diagnoses per year. If detected at an early stage, it can be treated through chemotherapy, with 5-Fluorouracil being a promising treatment option. However, this medication is accompanied by a significant number of side effects, making the treatment process unpleasant for patients. In this study, 5- FU was loaded into chitosan nanoparticles using an ionic gelation method, with the aim of reducing the drug's side effects and evaluating the cytotoxicity of the prepared nanoparticles. The prepared nanoparticles were characterized in terms of particle size, particle size distribution, zeta potential, morphology, encapsulation efficacy, in-vitro release, and in-vitro cytotoxicity. The nanoparticles were prepared in a pH of 4.5 using a 5:1 chitosan to tripolyphosphate ratio, resulting in a particle size of 217.03 ± 10.41, a PdI of 0.37 ± 0.11, and a zeta potential of 0.02 ± 0.02. The encapsulation efficacy was calculated as 15.69%, with a sustained release profile of approximately 40% over 24 hours. The cytotoxicity analysis showed that 5-FU-loaded chitosan nanoparticles effectively stopped the proliferation of CT-26 colorectal cancer cells with a lower concentration of 5-FU compared to free 5-FU. In conclusion, the prepared nanoparticles exhibit stable, uniform distribution, appropriate particle size, and efficient encapsulation capability. Furthermore, they demonstrate an initial burst release followed by sustained release after 24 hours, making them a promising candidate for the treatment of colorectal cancer with further in-vivo investigations and clinical trials.
Melanomanın topikal yolla tedavisine yönelik metformin yüklü polikaprolakton nanopartikül içeren jel formülasyonu hazırlanması ve In Vitro değerlendirilmesi
Melanoma metastaz yeteneği yüksek olan, tedavisi en zor kanser türlerindendir. Melanoma tedavisinde kullanılan kemoterapötik ilaçlara direnç gelişmesi nedeniyle tedavi etkinliği düşüktür. Bunun yanı sıra kemoterapötik ilaçlar ile sistemik yan etkiler de görülebilmekte, bu da sağlıklı dokularda hasar meydana getirebilmektedir. Melanoma tedavisinde kemoterapiye ek olarak, radyoterapi, fotodinamik terapi ve gen terapisi de uygulanmaktadır. Ancak bu yöntemlerin de üstünlükleri ve sakıncaları bulunmaktadır. Kötü prognoz ve tedavideki yetersizlikler göz önüne alındığında, melanomada yenilikçi tedavilere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada terapötik madde olarak melanomada antikanser etkinliği olduğu literatür çalışmalarında gösterilmiş biguanidin türevi bir antidiyabetik olan metformin HCl (Met) seçilmiştir. Etkin maddenin patolojik bölgeye lokal olarak uygulanabilmesi ve metforminin nanopartiküllere yüklenmesiyle topikal uygulama sonrası deride tutulumunun arttırılması amaçlanmıştır. Topikal uygulamalarda derinin en üst tabakası olan stratum korneumun aşılması zor olmakta ve tedaviyi sınırlamaktadır. Tez çalışmamızda etkin madde Polikaprolakton (PCL) nanopartikül içine hapsedilerek partikül boyutu küçültülmüş ve etkin maddenin deriye penetrasyonu arttırılmıştır. Hücre kültürü çalışmaları ile metformin HCL yüklü PCL Nanopartikül (NP) içeren Kitosan (CS) jel formülasyonunun serbest metformin içeren jele kıyasla daha etkili olduğu görülmüştür. Yapılan in vitro karakterizasyon ve ex-vivo çalışmalar sonucunda melanomanın topikal yolla tedavisinde Met yüklü PCL nanopartikül içeren kitosan jel formülasyonunun umut vaad eden sistemler olduğu sonucuna varılmıştır.
Tek distal uzantılı zirkonyum restorasyonları destekleyen ti-altyapılı zirkonyum dayanakların yorulma dayanımlarının ve kırılma direnclerinin in vitro olarak incelenmesi
Bu in vitro çalışmanın amacı hibrit dayanak tutuculu distal uzantılı monolitik zirkonya restorasyonların dinamik ve statik yükleme sonrası olası mekanik başarısızlıklarının ve kırılma dirençlerinin değerlendirilmesi olmuştur. Mandibular birinci ve ikinci premolar dişleri taklit eden implant destekli distal uzantılı restorasyonlar BDT/BDÜ sistemi yardımıyla tasarlanarak üretilmiş ve restorasyonları destekleyen dayanak şekline göre iki grupa ayrılmıştır: Grup 1; her bir örnekteki dayanaktan biri anti rotasyonel parça içeren (n=10), Grup 2; anti-rotasyonel parça içermeyen (n=10). Hibrit dayanakların her biri ve zirkonya restorasyonların iç yüzeyi tribokimyasal olarak kaplanmıştır. Sonra tüm dayanaklar implantlar üzerine 30 N tork değerinde sabitlenmiş ve monolitik restorasyonlar dayanaklara adeziv olarak simante edilmiştir. Simantasyon işlemi sonrası örnekler dinamik yükleme için çift eksenli çiğneme simülatöründe 50 N kuvvet varlığında 1.200.000 döngü ısıl ve mekanik yorulma yüklemesine tabi tutulmuştur. Daha sonra örnekler statik yükleme cihazında statik yüklemeye maruz bırakılmıştır. Olası başarısızlıklar Taramalı Elektron Mikroskobu yardımıyla incelenmiştir. Çiğneme simülatörü sonrası restorasyonların sağkalım ve başarı oranı %100 olmuştur. Grup 1 ve Grup 2 için ortalama kırılma direnci değeri sırasıyla 706.2N ve 873.7N olmuştur. Statik yükleme verilerine göre test edilen tüm örneklerin maksimum kırılma direnci verileri ağız içi posterior alandaki kuvvet değerlerinin üzerinde bulunmuştur. Gruplararası fark istatistiksel olarak anlamlı olmasa da anti rotasyonel parça içermeyen grup örnekleri daha yüksek kırılma direnci göstermiştir. Bu in vitro çalışmanın sınırlamaları dahilinde, doğru okluzal uyumlamalar ve okluzal temaslar varlığında hibrit dayanıklı distal uzantılı monolitik zirkonya restorasyonların posterior alanda kullanılabileceği söylenebilir.
İnsan göbek kordon veni CD146+ hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen matriks proteinlerinin in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesi
Yaraların tedavilerinde antimikrobiyal etkileri olan hücrelerin veya hücrelerden arındırılmış deselülerize matrikslerin yara bölgesine uygulanması son yıllarda dikkat çekmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, antimikrobiyal etkiye sahip olabileceği düşünülen CD146+ kök hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen ekstraselüler matriks proteinlerinin (deselülerize matriks) in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, CD146+ kök hücrelerin karakterizasyonu; hücre yüzey belirteçlerinin tayini ve farklılaşma analizleriyle, deselülerize matriksin karakterizasyonu; histolojik/immünfloresan boyamalar ve proteom analizleri ile belirlendi. CD146+ kök hücrelerin, biyofilm oluşumuna katkısını gözlemleyebilmek için, Pseudomonas (P.) aeruginosa ve Staphylococcus (S.) aureus bakterileri ile ko-kültürleri yapılarak hücre canlılık ve proliferasyonları WST-1, Annexin V/PI ve kristal viyole ile değerlendirildi. Aynı zamanda CD146+ kök hücrelerin, olası antimikrobiyal etkilerinin gözlemlenmesi amacıyla disk difüzyon yöntemi kullanıldı. CD146+ kök hücrelerin ve deselülerize matriks proteinlerinin biyofilm oluşumuna etkileri damlamalı akış modelinde test edilerek biyofilm oluşumunda görev alan genlerin ekspresyon seviyeleri kantitatif reverse transkriptaz-PZR yöntemiyle belirlendi. Elde edilen veriler sonucunda; CD146/105+ kök hücrelerin adipojenik yönde farklılaşabildiği ancak osteojenik farklılaşma kapasitelerinin bulunmadığı saptandı. Deselülerize matriks karakterizasyonu, DAPI ve Masson-Trikrom boyamaları ile tayin edildikten sonra proteom analizleriyle matriks bileşenlerinde kollajen, glikoprotein, proteoglikan ve büyüme faktörleri saptandı. Bakteri + hücreli/deselülerize kültürlerde, bakterilerin proliferasyonlarını arttırdıkları gözlemlendi. P. aeruginosa ve S. aureus kullanılarak tasarlanan biyofilm modelinde, deselülerize yapının P. aeruginosa biyofilm oluşumunu anlamlı olarak azalttığı, S. aureus için ise hücreli gruba kıyasla deselülerize grupta anlamlı bir fark bulunmadığı belirlendi. Gen ekspresyon analizi sonuçlarına göre, P. aeruginosa biyofilm ile ilişkili genlerden rhlR ve LasR için anlamlı azalım saptanmış olup, bu biyofilm hücre sayım sonuçlarını destekler niteliktedir. S. aureus' un tutunma genleri olan icaADBC genlerinin hepsi deselülerize grupta yüksek oranda eksprese edilmiştir. Bu tez çalışması, hedeflenen amaç doğrultusunda insan kaynaklı fetal kök hücrelerin ve onlardan elde edilen matriks proteinlerinin klinik uygulamalarda önemini ortaya koyan ilk çalışmadır. Anahtar kelimeler : CD146+ hücreler, kök hücreler, biyofilm, ekstraselüler matriks proteinleri, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, göbek kordonu.
Bazı bakteriyel balık patojenlerinde biyofilm oluşumuna farklı maddelerin in vitro etkisinin tespiti
Bu çalışmada, bakteriyel balık patojenlerinden Staphylococcus warneri, Aeromonas sobria, Yersinia ruckeri, Flavobacterium psychrophilum, Vibrio anguillarum'da adezyon oluşumu ve biyofilm oluşumu incelenmiştir. Ayrıca bu suşlar ile lizozim, malik asit, sarımsak yağı, kekik yağıyla biyofilm inhibisyon testleri ve ahşap, metal, fiberglas, cam gibi farklı materyallerde biyofilm oluşumları araştırılmıştır. Adezyon testinde plaklarda oluşan bir saatlik tutunma incelendiğinde negatif kontrolde 0,036 iken V. anguillarum'da 0,044, A. sobria'da 0,056, S. warneri'de 0,040, Y. ruckeri'de 0,050, F. psychrophilum'da 0,059 absorbans değerleriyle adezyon oluşturduğu bulunmuştur. Adezyon gücü F. psychrophilum'da diğer patojenlere oranla çok daha güçlü olduğu saptanmıştır. Adezyon testinde absorbans değerlerine göre yüzeye yapışma gücü sırayla F. psychrophilum, A. sobria, Y. ruckeri, V. anguillarum, S. warneri olarak belirlenmiştir. Biyofilm tespiti için kullanılan tüp yönteminde F. psychrophilum'da (++), A. sobria'da (++), S. warneri'de (+), Y. ruckeri'de (-), V. anguillarum'da (-) olarak tespit edilmiştir. Tüp testinde tüpün iç yüzeyinde oluşan film tabakasının kalınlığına göre sırayla F. psychrophilum, A. sobria, S. warneri, Y. ruckeri, V. anguillarum olarak belirlenmiştir. En güçlü biyofilm oluşumu F. psychrophilum ve A. sobria'da görülmüştür. Mikroplaklarla yapılan biyofilm testinde plaklarda oluşan biyofilm negatif kontrolde 0,048, S. warneri'de 0,121, A. sobria'da 0,158, Y. ruckeri'de 0,071, F. psychrophilum'da 0,172, V. anguillarum'da 0,212 absorbans değeri tespit edilmiştir. Mikroplak testinde biyofilm oluşumu sırayla V. anguillarum, F. psychrophilum, A. sobria, S. warneri, Y. ruckeri olarak belirlenmiştir. Mikroplak yönteminde en güçlü biyofilm oluşumu V. anguillarum'da bulunmuştur. Kongo red agar testinde biyofilm (slime) oluşturan bakterilerin koloni morfolojisinin renk değiştirmesine göre biyofilm oluşumu sırayla V. anguillarum, A. sobria, S. warneri, F. psychrophilum, Y. ruckeri olarak belirlenmiştir. Kongo red agarda kuru kristalize siyah koloni üreterek en güçlü biyofilm oluşumu V. anguillarum, A. sobria, S. warneri'de bulunmuştur. Pembe renkli koloni üreten F. psychrophilum ve Y. ruckeri bakterileri ise bu teste biyofilm oluşumu göstermemiştir. Mikroplak testindeki biyofilm oluşumu pozitif kontrol olarak değerlendirildiğinde lizozim, malik asit, sarımsak yağı, kekik yağı maddelerinin in vitro antibiyofilm etkisi araştırıldığında bu maddelerin çok etkili bir biyofilm inhibisiyon maddesi olduğu tespit edilmiştir. Ahşap, metal, fiberglas, cam gibi malzemlerde biyofilm oluşumu ile yapılan testlerde patojenlerin tamamının yetiştiricilik tesislerinde birçok alanda kullanılan bu materyallerde biyofilm oluşturduğu kanıtlanmıştır. Genel olarak cam, fiberglas, çelik ve ahşap yüzeylerde biyofilm oluşum gücü sırayla S. warneri, A. sobria, V. anguillarum, F. psychrophilum, Y. ruckeri olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak; S. warneri, A. sobria, V. anguillarum, F. psychrophilum, Y. ruckeri'nin farklı materyallerin yüzeylerinde biyofilm oluşturdukları ve lizozim, malik asit, sarımsak yağı, kekik yağı maddelerinin antibiyofilm maddesi oldukları tespit edilmiştir.
In vitro koşullarda farklı dozlarda bor uygulamalarının mersin (Myrtus communis L.)' de morfolojik ve biyokimyasal özellikler üzerine etkileri
Araştırmada siyah meyveli bir mahalli çeşit olan 'tatlı mersin' genotipinin sürgün uçları materyal olarak kullanılmıştır. Bu çalışma ile ortama eklenen bor konsantrasyonlarından toksisite problemi yaratabilecek bor (B) düzeyi belirlenmeye çalışılmış, olası B stresi altında morfolojik ve biyokimyasal özelliklerdeki değişimler incelenmiştir. Bu amaçla 6 farklı H3BO3 dozu (12.4 mg L-1, 18.6 mg L-1, 24.8 mg L-1, 31 mg L-1, 37.2 mg L-1, 43.4 mg L-1) Murashige ve Skoog (MS) ortamına eklenmiş ve kontrol grubu ile bitkilerin gelişimleri takip edilmiştir. Araştırmada kontrol ortamındaki bitkilere yalnızca MS ortam içeriğindeki standart B miktarı (6.2 mg L-1) ilave edilmiştir. İstatistiki değerlendirmelerin incelenmesi sonucunda; sürgün sayısı, sürgün başına yaprak sayısı, sürgün yaş ağırlığı, toplam klorofil miktarları en düşük değerlerini B konsantrasyonunun en yüksek olduğu (43.4 mg L-1) ortamda sırasıyla 1.9 adet, 4.7 adet, 0.09 g, 50.3 mg g-1 olarak saptanmışlardır Araştırmada, en yüksek prolin miktarı 43.4 mg L-1 uygulamasında 11.6 µg ml-1 olarak elde edilirken, en düşük prolin miktarı kontrol grubunda 3.3 µg ml-1 olarak belirlenmiştir. Askorbat peroksidaz (APX), süperoksit dismutaz (SOD), peroksidaz (POD) enzim aktiviteleri uygulama dozları arttıkça yükselmiş, en düşük değer kontrol grubundaki bitkilerde belirlenmiştir. Sonuç olarak; yetiştirme ortamına eklenen H3BO3 miktarı arttıkça özellikle APX, katalaz (CAT), SOD, POD gibi stres mekanizmasında rol alan enzimatik antioksidan aktivitelerinde önemli derecede artış gözlemlenirken sürgün sayısı, sürgün başına yaprak sayısı, sürgün yaş ağırlığı, toplam klorofil gibi parametrelerde strese bağlı olarak azalma görülmüştür. Rejenerasyon oranı ve klorofil a değerinde ise istatistiki olarak önemli bir fark görülmemiştir. Çalışmanın sonucunda mersin bitkisinin B stresine karşı tolerans sınırlarının yüksek olduğu saptanmıştır.
Lisyantus (Eustoma grandiflorum) bitkisinde in vitro mikro çoğaltım olanaklarının araştırılması
Lisyantus çiçeklerinin uzun süre canlı kalması, birbiri ardına tomurcuklarının çiçeklenmesi ve gösterişli çiçekleri nedeniyle tercih edilen bir kesme çiçekli süs bitkisidir. Tüm dünyada hızla sektöre giren bitkinin üretimi ağırlıklı olarak hibrit çeşitlerin tohumlarından fide elde edilmesi ve bunların seralarda yetiştirilmesi yoluyla yapılmaktadır. Tohumlar ise yurt dışından ithal edilmektedir. Lisyantus'ta ıslah çalışmalarının başlatılması ve yerli ticari çeşitlerin geliştirilmesi önem taşımaktadır. In vitro çoğaltım teknikleri, ıslah döngülerini hızlandırmak için yardımcı olmaktadır. Lisyantusta in vitro mutasyon ve genetik transformasyon çalışmalarına zemin oluşturmak üzere doku kültürü yoluyla çoğaltım sistemini optimize etmek, bu çalışmanın amacını oluşturmaktadır. In vitro koşullarda çimlendirilen lisyantus tohumlarından gelişen fidelerden yaprak eksplantları hazırlanarak 20 farklı bileşime sahip MS temel besin ortamında kültüre alınmıştır. Sitokinin olarak BAP ve TDZ'nin 5'er dozu (0.5, 1.0, 2.0, 3.0 ve 4.0 mg/L) ile bunların 0.5 mg/L NAA ile hazırlanan kombinasyonları kullanılmıştır. Kontrol ortamı olarak hormonsuz MS kullanılmış olup, bu ortamda sürgün gelişimi meydana gelmemiştir. BGD içeren tüm besin ortamlarında organogenesis elde edilmiştir. Eksplant başına 7.22-15.6 arasında sürgün sayısı elde edilmiş, MS4 ve MS9 ortamları (3'er mg/L BAP veya TDZ) gelişim, sürgün sayısı özellikleri bakımından dikkati çekmiştir. TDZ'nin 3 ve 4 mg/L dozunda kullanıldığı ortamlarda eksplant başına 15.5 adet sürgün elde edilirken, BAP'nin 2 ve 3 mg/L dozunda kullanıldığı ortamlarda da buna benzer (15.1 sürgün/eksplant) sonuçlar alınmıştır. Bu çalışma ile lisyantus yaprak eksplantlarından başarıyla mikro çoğaltım yapılabilmesi için gerekli aşamalar tam olarak optimize edilmiştir. Sistem, hızlı çoğaltım veya in vitro ıslah yöntemlerinin kullanımına hazır hale getirilmiştir.
OH×F 333 ve OH×F 97 armut klon anaçlarının tuz stresine tepkilerinin ın vıtro koşullarda belirlenmesi ve silisyum uygulamasının etkileri
Bu çalışmada OH×F 333 ve OH×F 97 armut klon anaçlarının tuz stresine gösterdiği tepkiler ve Si uygulamalarının tuz stresinin azaltılmasındaki etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla 2 farklı deneme yapılmıştır. 1. denemede OH×F 333 ve OH×F 97 armut klon anaçlarının in vitro bitkileri kademeli olarak artırılan farklı konsantrasyonlarda tuz (0, 50, 100, 150 ve 200 mM NaCl) içeren ½ MS ortamında kültüre alınmıştır. 2. Denemede ise ½ MS ortamına bitkilerin kısmen zarar gördüğü 100 mM NaCl konsantrasyonuna ilave olarak 0.5, 1.0 ve 2.0 mM konsantrasyonlarında Na2O7Si3 ilave edilmiş ve bitkiler toplam 8 hafta bu ortamlarda inkübasyona tabi tutulmuştur. Deneme 1'de in vitro koşullarda tuz konsantrasyonları arttıkça, rejenerasyon oranı ve sürgün sayısı değerleri azalmış, zararlanma derecesi ise önemli derecede artmıştır. 200 mM NaCl uygulamasında çoğu sürgünün canlılıklarını yitirdikleri tespit edilmiştir. Artan tuz konsantrasyonlarının biyokimyasal parametreler üzerindeki etkisi incelendiğinde toplam fenolik madde, toplam flavonoid madde, prolin ve çözünebilir protein içeriklerinin azaldığı, lipid peroksidasyon içeriğinin ise tuz konsantrasyonlarına paralel şekilde arttığı belirlenmiştir. Ancak toplam fenolik ve flavonoid madde içeriklerinde 150 mM NaCl uygulamasında tekrar bir yükselişin olduğu tespit edilmiştir. Deneme 2'de ise Si uygulamalarının tuz stresinin olumsuz etkilerinin giderilmesi yönünde önemli bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Deneme 2'de toplam fenolik ve toplam flavonoid madde içerikleri artan Si konsantrasyonuna paralel olarak OH×F 333 anacında artarken, OH×F 97 anacında azalmıştır. Her 2 anacın lipid peroksidasyon içeriği Si konsantrasyonuna paralel olarak azalırken, prolin içeriğinin nispeten arttığı görülmüştür.
Şanlıurfa'da yetiştirilen bazı ağaç yapraklarının besin madde içeriği ve sindirilebilirliklerinin belirlenmesi
Bu çalışmada Şanlıurfa'da yetiştiriciliği yapılan dut (Morus sp.), akasya (Robinia pseudoacacia) ve çınar ağaçlarından (Platanus orientalis) 45 gün aralıklarla 4 kez alınan (15 Temmuz- 1 Aralık Dönemi arasında) yaprakların besin madde kompozisyonu ve in- vitro kuru madde sindirim değerleri belirlenmiştir. Çalışma sonunda, ağaç yapraklarının besin madde kompozisyonları bakımından ADF değerleri hariç diğer besin madde içerikleri üzerine ağaç türü x hasat zamanı interaksiyonlarının etkisi gözlenmiştir (P<0.01). ADF değerleri üzerine ağaç türü ve hasat zamanın etkisi önemli bulunmuştur (P<0.0001). Benzer şekilde de in vitro kuru madde sindirimi, kuru madde alımı ve nisbi yem değerleri üzerine ağaç türü x hasat zamanı interaksiyonları gözlenmiştir (P<0.01). Sindirilebilir kuru madde değerleri üzerine ağaç türü ve hasat zamanın etkisi önemli bulunmuştur (P<0.0001). Sonuç olarak, in vitro kuru madde sindirimi ve ham protein değerleri açısından dut ve akasya ağacı yapraklarının iyi kalitede kaba yem kaynağı olabileceği fakat çınar ağacı yapraklarının bu özellikler açısında yeterli olmadığı sonucuna varılmıştır.
Bir kemoterapi ajanı olan paklitakselin kanser kaşeksisi üzerine etkisinin in vitro araştırılması
Kaşeksi; geleneksel beslenme desteği ile tamamen geri döndürülemeyen, ilerleyici fonksiyonel bozukluklara yol açan, iskelet kası ve adipoz doku kaybı ile karakterize edilen çok faktörlü bir sendromdur. Kaşeksinin potansiyel biyobelirteçlerinden olan ve AZGP1 (Alpha-2-Glycoprotein 1, Zinc-Binding) geni tarafından kodlanan çinko-α2-glikoprotein (ZAG), adipoz dokuda lipit sentezini düzenleyici bir faktör olarak tanımlanmıştır. Adipoz doku, öncü adipositlerin PPARγ ve C/EBPα gibi transkripsiyon faktörlerinin etkisi ile olgun adipositlere dönüştüğü adipogenez süreci sonucunda oluşmaktadır. AZGP1'in, bu transkripsiyon faktörlerini baskılayarak adipogenezi ve lipit birikimini engellediği bildirilmiştir. Bununla birlikte AZGP1'in, beyaz adipositlerin kahverengi adipositlere dönüşümünü tetiklediği ve kaşekside yağ katabolizmasını arttırarak adipoz doku kaybına katkı sağlayabileceği bildirilmiştir. Kemoterapi spesifik tedavi hasarı oluşturmasının yanı sıra, beslenme ve metabolik durum değişikliklerine neden olarak kaşeksiye doğrudan veya dolaylı olarak katkı sağlayabilir. Paklitaksel birçok kanser türünün tedavisinde sıklıkla kullanılan bir kemoterapötik ajandır. Bu çalışmada, paklitakselin kanser kaşeksisi üzerindeki etkisi, lipit birikimi ve kaşeksi ilişkili AZGP1 geni ifadelenmesi yoluyla araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada, insan öncü adiposit hücreleri 37°C ve %5 CO2 şartlarında ticari olarak satın alınan öncü adiposit büyüme besiyerinde çoğaltılmıştır. Çoğalan hücreler 12 kuyucuklu hücre kültür tabaklarına 105 hücre/kuyu olacak şekilde ekilmiş ve farklılaşmanın tamamlanma süreci olan 15 gün boyunca 3 gün ara ile 50 nM paklitaksel + farklılaşma besiyeri uygulanmıştır. Uygulama zaman bağımlı olarak 0.gün, 3.gün, 6.gün, 9.gün ve 12.gün paklitaksel + farklılaşma besiyeri şeklinde yapılmıştır. 15. günün sonunda hücrelere lipit birikiminin tespiti için Oil Red O boyama ve gen ifade analizi için total RNA izolasyonu yapılmıştır. Adipogenez sürecinde zaman bağımlı olarak uygulanan paklitakselin AZGP1 gen ifadesine etkisi RT-PCR ile analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda, adipogenez sürecinde verilen paklitakselin, insan öncü adipositlerinde farklılaşmayı ve lipit birikimini baskıladığı (p<0.01) tespit edilmiştir. Gen ifade analizi sonucunda AZGP1; 0.gün, 6.gün, 9.gün ve 12.gün sırasıyla 0.42, 0.44, 0.5 ve 0.36 kat daha az ifadelenme göstermiş ancak 3.günde AZGP1 ifadelenmesinde bir değişim olmamıştır (p>0.05). PPARγ gen ifadesi 0.gün, 3.gün ve 6.gün sırasıyla 0.03 (p<0.05), 0.65 ve 0.9 kat daha az ifadelenme göstermiş ancak 9.gün ve 12.günde sırasıyla 2.29 (p=0.015) ve 3.99 (p=0.003) kat daha fazla ifadelenme gösterdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, paklitakselin lipit birikimi baskılayarak kanser kaşeksisinde adipoz doku kaybına katkı sağlayabileceği ancak bu süreçte kaşeksi ilişkili AZGP1 ve adipogenez ilişkili PPARγ gen ifade düzeylerinde gösterdiği değişimin daha fazla çalışma ile analiz edilmesi gerektiği tespit edilmiştir.
İn vitro ortamda insülin reseptör substrat 1 (IRS1) bağımlı sinyal iletim ağının glioblastoma multiforme gelişimindeki rolünün belirlenmesi
Beynin temel enerji kaynağı glukozdur ve beyin, glukozu yoğun bir şekilde kullanmaktadır. Dolayısıyla beynin fizyolojik rolünü yerine getirmesi, glukoz metabolizmasının sıkı bir şekilde kontrolü ile sağlanmaktadır. İnsülin Reseptör Substrat (IRS) proteinleri, glukoz metabolizmasının regülasyonunda rol alan en önemli adaptör proteinlerdir. IRS1 bu protein ailesinin üzerinde en çok çalışılan elemanıdır. IRS1, kanserle ilgili birçok reseptörle etkileşime geçmektedir ve literatürde IRS1'in meme, akciğer, prostat, böbrek gibi birçok kanser türünde ekspresyon artışı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda merkezi sinir sistemi tümörlerinden biri olan medulloblastomda da IRS1 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Bizde bu bilgiler ışığında, IRS1'in merkezi sinir sisteminin bir diğer önemli tümörü olan glioblastoma multiforme (GBM) gelişiminde de böyle bir ekspresyon artışı olabileceğini düşündük. Buradan yola çıkarak in vitro ortamda IRS1 bağımlı sinyal iletim ağının GBM gelişimindeki rölünü belirlemeyi amaçladık. Çalışmada, U-87 MG hücre hattı kullanıldı. IRS1 proteinin ekspresyonunu U-87 MG hücrelerinde arttırmak amacıyla pcDNA3.1-flag tagged-insan IRS1 ekspresyon vektörü lipofektamin aracılığı ile hücrelere transfekte edildi. Ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücrelerinin sağkalımı üzerindeki fonksiyonel etkisi MTT analizi, insülin sinyali üzerindeki moleküler etkisi western blot analizi ile belirlendi. Elde ettiğimiz sonuçlar, ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücre sağkalımını arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, IRS1 ekspresyon artışının, insülin indüklü Grb2, ERK ve AKT proteinlerinin aktivasyonlarında artış gerçekleştirdiği saptanmıştır. Çalışmamız, GBM hücrelerinde IRS1 ekspresyon ve aktivasyon artışının, hücre sağkalımını AKT aktivasyonu aracılığıyla arttırdığını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Beyin Tümörleri, Glioblastoma Multiforme, IRS1, İnsülin Reseptör Substrat Proteinleri (IRS), İnsülin Sinyali.
Farklı düzeylerde kekik yaprağı ilavesinin yonca kuru otunun in vitro sindirim parametrelerine etkisi
Bu projede, farklı düzeylerde kekik yaprağı ilave edilen yonca kuru otunun in vitro KM, OM sindirilebilirliği, ME düzeyleri ile rumen parametrelerine etkisinin belirlenmesi öngörülmüştür. Bu amaçla yonca kuru otuna sırası ile %2, 4 ve 6 düzeyinde kekik yaprağı ilave edilerek daisy inkübatörde 48 saat inkübasyona bırakılacaktır. İnkübasyonun başında ve sonunda rumen parametrelerinin belirlenmesi amacı ile rumen sıvı örnekleri alınacaktır. Bu örnekleme periyodunda da in vitro sindirim parametreleri belirlenecektir. Dünya'da ve ülkemizde giderek etkilerini artırmakta olan sera gazı salınımının iştirakçısı olan çiftlik hayvanlarının tüketmiş oldukları besin maddelerinin rumende fermantasyonu sonucu doğal olarak metan gazı oluşmakta ve böylelikle hem ekolojik riskler hem de önemli oranda enerji kaybı söz konusu olmaktadır. Hayvansal ürünlere olan talebin karşılanması ve artan hayvansal üretim faaliyeti açısından ruminantlarda besin maddelerinin sindirim parametrelerinin, söz konusu hayvan lehine aromatik bitkiler ile değiştirilmesine yönelik araştırma alanı oldukça günceldir. Dolayısıyla bu yüksek lisans tezinden elde edilebilecek sonuçların, hayvan besleme alanına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir. Hayvan beslemede büyüme uyarıcıları olarak kullanılan antibiyotiklerin çiftlik hayvanlarında kalıntı bırakması ve dirençli bakterilerin gelişimini artırması nedeniyle alternatif doğal maddelerden yararlanma öncelik kazanmıştır. Bu maddeler içerisinde yer alan kekik yapraklarının bünyesinde bulunan etken maddelerin antimikrobiyal ve antioksidan etkileri sayesinde rumen fermantasyonu ve besin maddelerinin sindiriminde önemli rol oynadığı ileri sürülmektedir. Dolayısıyla yöreye özgü doğal olarak yetişen kekik bitkisinin ruminantlarda sindirim ve rumen parametrelerine etkisinin tespiti de bitkinin bünyesindeki aktif bileşiklerin etkinliğinin bilinmesi bakımından önemlidir.
Sodyum florür (NAF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine etkisinin in vitro olarak araştırılması
Korkmaz R, Sodyum Florür (NaF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine Etkisinin in vitro olarak araştırılması. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya (Veteriner) Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2020. Bu tez çalışması, yüksek elektronegativiteye sahip flor elementinin neden olduğu hücre içi moleküler mekanizmaların düzenlenmesinde önemli bir role sahip PI3K/AKT yolağına olan etkisini ortaya koymak amacıyla plandı.Bu amaçla, flordan ençok etkilenen dokuların başında böbrek dokusu geldiği için çalışma materyalı olarak NRK-52E rat böbrek epitel hücresi seçildi. Çalışmada flor kaynağı olarak NaF kullanıldı. Uygulanacak NaF konsantrasyonu MTT canlılık testi ile belirlendi. NaF konsantrasyonları 24 saat için proliferasyon artırıcı konsantrasyon olan (10 μM) ve sitotoksik konsatrasyonlar olan IC25 (2250 μM) ve IC50 (4250 μM) olarak belirlendi ve uygulandı. Çalışmada PI3K/AKT yolağında önemli role sahip olan genler ERBB2, PI3K, AKT ve mTOR genleri ile TP53 geni hedef genler olarak düşünüldü. Belirlenen NaF konsantrasyonu hücrelere uygulandı ve 24 saatin sonunda çalışma gruplarında total mRNA izole edildi. Elde edilen mRNA'lar cDNA'ya çevrildi. Elde edilen cDNA'lar kullanılarak hedef genlerin ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı-qPCR yöntemiyle tespit edildi. Çalışma sonunda elde edilen sonuçlara göre düşük konsantrasyonda verilen NaF konsantrasyonun ERBB2, PI3K, AKT genlerini ekspresyonunu artırdığı, yüksek konsantrasyonda ise değiştirmediği tespit edildi. mTOR ise verilen tüm konsantrasyonlarda ekspresyonunun azaldığı ortaya konuldu. TP53 geni ise düşük konsantrayonda değişmediği, yüksek konsantrasyonda ise artış gösterdiği belirlendi. Yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlar ve literatürlere göre, florun PI3K/AKT yollağında yer alan kinaz enzimlerini inhibe edebileceği ve bunun sonucunda bazı genlerin ekspresyonunun azalmasına veya artışına neden olabileği sonucuna varılabilir. Özet olarak NRK-52E böbrek epitel hücre serisinde florun neden olduğu hücre hasarının patogenezinde PI3K/AKT/mTOR yolağı önemli bir sinyal yolağıdır
İmmünokemoterapötik nanoplekslerin kolon kanseri tedavisinde etkinlik ve güvenliğinin in vitro - in vivo değerlendirilmesi
Kolon kanseri tedavisinde cerrahiden sonra en sık kullanılan yöntem kemoterapidir. Ancak kanser hücreleri, hayatta kalmak için immün sistem hücrelerinin tanıma mekanizmasından kaçmakta ve farklılaşma yetenekleri ile kemoterapötiklere karşı direnç geliştirmektedirler. Bu nedenle, kemoterapinin yanı sıra immünoterapinin de kullanılmasının tedavinin etkinliğini artırabileceği bilinmektedir. Nanopleksler, zıt yüklerin etkileşimine dayalı oluşan nano boyutlu sistemlerdir ve bu çalışmada nanopleks yapısını oluşturmak için siklodekstrin (CD) polimeri, 5-Florourasil (5-FU) ve İnterlökin-2 (IL-2) kullanılmıştır. Nanoplekslerin ortalama partikül büyüklükleri ve dağılımı, yüzey yükü tayini, ilaç yükleme etkinliği, her iki etkin madde için farklı ortamlarda salım profili belirleme ve çeşitli stabilite çalışmaları yapılmıştır. Konvansiyonel hücre kültürü çalışmalarında CD polimerlerin güvenliliği hücre proliferasyonuna etkisi ile belirlenmiştir. Ardından ilaç yüklü nanoplekslerin etkinlikleri 2-boyutlu hücre kültürü ve gerçek zamanlı hücre canlılığı analizi ile belirlenmiştir. 3-boyutlu hücre kültürü çalışmaları ile nanoplekslerin etkinliği hücre canlılığı, immünohistokimyasal inceleme ve elektron mikroskobu incelemesi ile belirlenmiştir. Yapılan in vivo çalışmalarla ise CD polimerlerin güvenlilikleri sağlıklı farelerde tek doz intravenöz (i.v.) uygulama sonrası alınan kan örnekleri ile belirlenmiştir. Son olarak, tümör indüklenen farelerde, nanoplekslerin antitümöral etkinlikleri hayatta kalma oranı, metastaz ve immün cevap açısından belirlenmiştir. Çalışmaların sonucunda, IL-2 ve 5-FU'yu birlikte taşıyan nanopleksler hazırlanmış ve parenteral yoldan kolorektal immünokemoterapi açısından umut vaat eden bir model ilaç taşıyıcı sistem ortaya konmuştur. Anahtar kelimeler: immünokemoterapi, kolon kanseri, kombine ilaç taşınımı, nanopleks, siklodekstrin
Farklı yöntemler ile enkapsüle edilen probiyotiklerin in vitro ve in vivo etkinliğinin belirlenmesi
Probiyotiklerin belirtilen etkilerini hastalık durumlarında göstermesine karşın sağlıklı bireylerde etkinliğinin değerlendirildiği oldukça az sayıda çalışma vardır. Bu çalışmanın amacı; farklı probiyotik türlerinin farklı yöntemlerle enkapsüle edilerek, in vitro koşullarda canlılık düzeylerinin değerlendirilmesi, kısa süreli depolama koşullarında stabilitelerinin belirlenmesi ve in vivo koşullarda farklı türdeki probiyotik bakterilerin, sağlıklı fare dokularında inflamasyon biyogöstergeleri üzerine etkilerinin incelenmesidir. Çalışmada ilk olarak, inflamasyonda etkili olduğu belirtilen Lactobacillus rhamnosus (LGG) ve Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) probiyotik bakterilerinin mikroenkapsülasyon (ME) ve nanoenkapsülasyon (NE) yöntemleri ile enkapsülasyonu (EK) yapılmıştır. In vitro koşullarda canlılık düzeyi daha yüksek bulunan EK yöntemi seçilerek, bir hafta boyunca depolamadaki (+4°C) stabiliteleri değerlendirilmiştir. Çalışmanın in vivo aşamasında, C57BL/6J türü 35 adet sağlıklı erkek fare çalışmaya dahil edilmiştir. Farelere üretilen ME probiyotikler ve fosfat buffer saline (PBS); 6 hafta boyunca her gün oral gavaj ile verilmiştir. Müdahalenin sonunda karaciğer dokularından PCR ile inflamatuvar sitokinlerin (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α ve IFN-γ) gen ekspresyon düzeyleri analiz edilmiştir. Çalışmanın sonunda; in vitro koşullarda serbest bakterilerin canlılığını büyük oranda kaybettiği (p<0.05), her iki yöntemle enkapsüle edilen bakterilerde ise canlılık oranlarının daha yüksek olduğu bulunmuştur (EcN için, p<0.05 ve LGG için p>0.05). Yöntemlere göre bakterilerin canlılığını koruma düzeylerine bakıldığında ise LGG için benzer oranlarda koruduğu görülürken (ME için, %41,9±1,24 ve NE için, %41,2±7,05), EcN için nanofiberle enkapsülasyona kıyasla, ME yönteminde canlılığın daha yüksek olduğu bulunmuştur (sırasıyla %71,2±1,65 ve %83,9±1,31, p<0.05). ME ve serbest formda bulunan bakteriler bir hafta depolandığında (+4°C), depolama süresince 1, 3 ve 7. günlerdeki canlılığında anlamlı bir azalma olmadığı görülmüştür (p>0.05). IFN-γ gen ekspresyon düzeylerinde serbest EcN, ME EcN ve kontrol grupları arasında anlamlı bir fark olduğu görülmüştür (p=0.048). IL-6, TNF-α, IL-4 ve IL-10'un gen ekspresyon düzeylerinde gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0.05). Bu çalışmanın sonuçları, in vitro koşullarda probiyotiklerin serbest formlarına kıyasla enkapsüle formlarının canlılıklarını daha iyi koruduğunu ve stabilitelerini arttırdığı, ayrıca sağlıklı farelerde probiyotik kullanımının inflamasyon üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığını göstermiştir. Bu çalışma sonuçlarının, farklı materyaller kullanılarak nanofiberle enkapsülasyon yöntemleri ve bu doğrultuda üretilen ürünlerin etkinliklerinin sağlıklı bireylerde de değerlendirilmesine yönelik yapılacak çalışmalara yol gösterici olacağı düşünülmektedir.
Gıda matrisi ve mikroplastik etkileşiminin incelenmesi
Plastik üretimi son yıllarda artarak katlanmıştır ve 2019 yılında Avrupa'da 57.9 milyon tona, dünyada ise 368 milyon tona ulaşmıştır. Plastik polimerler günümüzde paketleme, tarım, günlük ihtiyaç gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Polistiren Avrupa'da en çok kullanılan polimerler arasındadır. Plastik parçacıklar arasında boyutu 5 mm'den küçük boyutta olanlar mikroplastik (MP) olarak tanımlanmaktadır. Mikroplastikler bu zamana kadar doğada atmosferde, okyanuslarda, göllerde, tarımsal arazilerde ve midye, konserve balık, tuz, paketlenmiş et ürünleri ve şişelenmiş sular gibi yiyecek ve içeceklerde tespit edilmiştir. Mikroplastiklerin gıdalarda bulunmasından dolayı diyet yolu ile tüketilebilmekte ve bu durum insan sağlığına tehdit oluşturmaktadır. Bunun sonucunda mikroplastiklerin, inflamasyona, organlarda birikime, sitotoksisiteye neden oldukları ve reaktif oksijen türlerinin oluşumunu indükledikleri gözlemlenmiştir. Partiküller protein içeren biyolojik çözeltilerin içinde, çözeltideki bazı proteinler partikül yüzeyini veya bir kısmını kaplamakta ve "protein korona" adı verilen bir yapı oluşmaktadır. Oluşan protein korona yapısı sitotoksisitesi de dahil olmak üzere partikülün birçok özelliğini etkilemektedir. Bu tez çalışmasında, polistiren mikroplastiğinin (PSMP) gerçek gıda ortamı ile etkileşiminin incelenmesi ve sindirimin korona yapısında oluşturduğu değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda yağlı ve yağsız süt örnekleri ile etkileştirilen PSMP'lerin hidrodinamik çaplarında anlamlı bir değişim olmadığı ancak ζ-potansiyellerinin azaldığı belirlenmiştir. Partikül yüzeyinde oluşan protein korona yapısında çoğunlukla, sütte bulunan α ve β-kazein fraksiyonlarının bulunduğu gözlemlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında PSMP'ler ve süt ile etkileştirilmiş PSMP'lere in-vitro sindirim simülasyonu uygulanmış ve sindirimin partikül özellikleri ve korona yapısı üzerine etkisi incelenmiştir. Süt örnekleri ile etkileştirilen ve sindirime maruz kalan PSMP'lerin protein korona yapısının inceldiği gözlemlenmiştir. Ayrıca sindirim boyunca partiküllerin sindirim sıvısındaki enzimleri de bağladığı gözlemlenmiştir. Süt ile etkileştirilmemiş PSMP'lerin sindirim boyunca korona yapısı oluşturduğu ve sindirim sonuna kadar artarak devam ettiği gösterilmiştir. Çalışmanın son aşamasında, süt ile etkileştirilmiş ve etkileştirilmemiş PSMP'lerin sindirim öncesi ve sonrasında, Caco-2 hücresi üzerindeki toksik etkileri incelenmiştir. Sitotoksisite analizleri sonucunda protein korona yapısının hücre canlılığı üzerinde bir etkisi olmadığı gözlemlenmiştir. Korona yapısına sahip partiküllerin reaktif oksijen türlerinin oluşumunu azalttığı görülmekle birlikte bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu tez çalışmasının sonunda, PSMP'lerin gerçek bir gıda ortamı ile etkileşimi sonucunda protein korona yapısı oluşturduğu gösterilmiştir. Ayrıca bu oluşan korona yapısının sindirim simülasyonu boyunca değiştiği gösterilmiştir. PSMP örnekleri Caco-2 hücreleri üzerinde hücre canlılığını etkilememiştir. Ancak, oluşan korona yapısının ve in-vitro sindirim simülasyonunun partiküllerin sitotoksisitesi üzerinde etkisi olmadığı saptanmıştır. Bu tez çalışmasında ilk kez, dünyada kirliliği gittikçe artan ve artık gıdalarımızda bulunmaya başlayan mikroplastiklerden biri olan polistiren mikroplastiğinin gerçek bir gıda ile etkileşimi ve bu etkileşimin partiküllerin karakteristik özellikleri üzerine etkileri araştırılmıştır.