Pluripotent stem cell (IPSCs)-derived hepatic organoids for modeling liver cancer

Karaciğer kasnseri, dünyada ölüm sıralamasında 4. sırada yer alan, tedavi seçenekleri çok sınırlı heterojen bir hastalıktır. En sık görülen tipi olan Hepatosellülar Karsinoma (HCC) genellikle siroz temelinde gelişen, geç tanı ve ilaç direnci ile karakterize bir kanserdir. HCC'de erken moleküler patofizyolojik değişikliklerin anlaşılmasında ve yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesinde en önemli sınırlılık, insan tümör oluşumunu taklit eden in vitro ve in vivo modellerin eksikliğidir. Bu kapsamda İPSC lerden üretilen hepatositlerde mikroçevrenin stemness ve senesens morfolojisindeki etkileşimleri incelenmiş olup (Karabicici, 2021) karaciğer kanserinin fibroz ve siroz gibi malign öncesi evrelerinin oluşumunu ve gelişimini modelleyen uzun vadeli ve büyük ölçekli bir 3D hücre kültürü modeli geliştirmek amaçlanmıştır. Bu kapsamda, İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (İPSCs) kaynaklı sağlıklı organoidlerde (eHEPO) en yaygın olarak mutasyona uğradığı bildirilen 3 driver genin (p53, APC ve NF1) hedeflenen gen modifikasyonu için CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılmıştır. Bu driver genleri hedefleyen CRISPR/Cas9 stratejisi, HEK293T hücrelerinde başarılı bir şekilde çalışmış olsa da, bu tez kapsamında yalnızca p53 KO eHEPO ların kanser tümör mikroçevresindeki yanıtları incelenmiştir. Bunun için p53'e özgü gRNA içeren px458 plazmitleri optimize edilmiş Nucleofector koşulları aracılığıyla eHEPO'lara transfekte edilmiştir. Sonrasında elde edilen GFP+ hücreler FACS ile ayrımlandıktan sonra, Nutlin-3a selektif ortamı içerisinde büyüyebilen p53 KO eHEPO klonları manuel olarak seçilmiştir. Pro-kanserojenik TME yi taklit etmek için aktive edilmiş LX2 ve M2 polarize hücre sekretomları, WT kontrollerinin yanı sıra p53 KO-eHEPO'ların büyüyen ortamına ilave edilmiştir. Bu işlem sonrasında P53-KO eHEPOlarda artmış proliferasyonun yanısıra (Ki67) artan nükleer-sitoplazmik oran, pleiomorfik ve hiperkromatik çekirdekler, psödo glandüler ve tübüler rozetler ve inflamatuar benzeri hücre morfolojisi dahil olmak üzere, prokarsinogenik tümör markerları gözlenmiştir. Ayrıca mason trichome boyanan alan ve fibrotik gen ekspresyonlarının önemli ölçüde arttığı gösterilmiştir. Sonuç olarak, HCC başlangıcındaki driver genlerden biri olan p53 KO eHEPO kullanılarak pro kanserojen bir mikroçevrede tümör oluşum mekanizmalarının anlaşılmasına önemli katkılar sağlayacak fibrotik bir organoid modelinin oluşturulabileceği gösterilmiştir.