Karaturp peroksidaz enziminin saflaştırılması ve benzohidrazidlerle inhibisyon kinetiğinin incelenmesi

Bu çalışmada karaturp peroksidaz enziminin (POD), inhibitörleri olan 3-Amino benzohidrazid ve türevi moleküller kullanılarak tek basamakta saflaştırılması hedeflendi. Bu amaçla, literatürde bulunan bitki POD saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak için 3-amino benzohidrazid ve onun türevleri olan 5-amino 2-metil benzohidrazid, 3-amino 5-metil benzohidrazid, 3-amino 4-nitro benzohidrazid ve 3-amino 2-metil benzohidrazid molekülleri sentezlendi ve POD enziminin saflaştırılmasında kullanıldı. Türev moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak, karaturp POD enzimi üzerine inhibisyon etkileri incelendi. Dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede karaturp POD enzimi saflaştırılması gerçekleştirildi. 3-Amino benzohidrazid molekülü kullanıldığında karaturp POD enzimi, %11,9 verimle 246,6 kat, 5-amino 2-metil benzohidrazid ile %43 verimle 733,5 kat, 3-amino 5-metil benzohidrazid ile %6,09 verimle 221,2 kat, 3-amino 4-nitro benzohidrazid ile %14,6 verimle 249,6 kat ve 3-amino 2-metil benzohidrazid ile %21,4 172,5 kat saflaştırma yapıldı. Bu kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi. Karaturp POD enziminin molekül ağırlığı için 43-47 kDa'da tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon materyali olan Sepharose-4B-L-Tirozin-5-amino-2-metil benzohidrazid kolonu için kolon tutma kapasitesi, karaturp POD enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. Karaturp POD enzimi için optimum şartlar: pH 7,0, sıcaklık 15°C, iyonik şiddet ise 0,4 M olarak belirlendi.