Kenevir tohum proteinlerinin ultrases, yüksek basınç ve manotermosonikasyon uygulamaları ile modifikasyonu

Dünya nüfusundaki hızlı artış trendi gelecekte gıda talebini karşılamada zorluklar yaşanacağına işaret etmektedir. Ayrıca, küresel salgınlar, savaşlar ve iklim değişiklikleri gıda zincirindeki olası sıkıntıları tetiklemektedir. Bu noktada sağlıklı beslenme düzeninde kilit rol oynayan proteinlerin tedariğinde yakın gelecekte sıkıntılar meydana geleceği öngörülmektedir. Özellikle hayvansal protein kaynaklarıyla ilişkili ekonomik, etnik ve dini nedenlere ek olarak bu kaynakların yarattığı çevre ve sağlık endişeleri araştırmacıları alternatif protein kaynakları üzerinde çalışmaya yönlendirmiştir. Bu bağlamda, bitkisel protein kaynakları bol, çeşitli, ucuz ve erişilebilir olmasıyla küresel markette hızlı bir şekilde yer edinmiştir. Artan tüketici bilinciyle birlikte sağlıklı, dengeli ve vejetaryen beslenmeye eğilim bitkisel protein talebine ivme kazandırmıştır. Özellikle gıda işleme atıklarının alternatif protein kaynağı olarak değerlendirilmesi, çevresel geri dönüşümü destekleyerek sürdürülebilir, katma değerli ve yenilikçi çözümler üretmesiyle önem taşımaktadır. Kenevir; lifi, tohumu ve yağı için uzun yıllardan beri yetiştirilen çok fonksiyonlu endüstriyel bir bitkidir. Son yıllarda yapılan yasal düzenlemelerle uyuşturucu (Marijuana) ve endüstriyel kenevir çeşitlerinin (Cannabis sativa, d–9–tetrahidrokannabinol (THC) <%0,3) ayrımının net bir şekilde yapılması çok değerli bileşenleri bünyesinde barındıran kenevir tohumu üzerindeki çalışmaları artırmıştır. Kenevir tohumu özellikle yapısındaki yüksek kaliteli protein ve yağ içeriğiyle dikkat çekmektedir. Yağ ekstraksiyonu sonrasında kalan küspe, %55–60 yüksek kaliteli -esansiyel amino asitlerce zengin- bir protein kaynağı olarak ortaya çıkmaktadır. Kenevir tohum proteini (KTP), düşük alerjenitesi, yüksek sindirilebilirliği ve biyoaktif özellikleri ile bilinmektedir. Bu açıdan KTP, gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılan ancak genetik modifikasyon, alerjenite ve düşük sindirilebilirliğiyle bilinen soya proteinine alternatif olarak görülmektedir. KTP'nin ekmek, et, kahvaltılık gevrek ve dondurma gibi gıda formülasyonlarının yapısında çeşitli amaçlarla kullanıldığı çalışmalar literatürde yer almaktadır. Buna rağmen KTP'nin gıda endüstrisinde yaygın kullanımı bulunmamaktadır. Bu durumun altında yatan nedenler, KTP'nin diğer bitkisel protein kaynakları gibi düşük çözünebilirliğe sahip olmasıdır (nötr pH'da ~%20). Gıda bileşen ve katkı maddelerinin gıda formülasyonlarında tercih edilebilmesi, sahip oldukları çoklu fonksiyonel özelliklerine bağlıdır. Düşük çözünebilirlik; protein süspansiyonlarının emülsiyon, köpük ve jel oluşturma gibi diğer birçok fonksiyonel özelliğini birincil derecede etkilediği için KTP'nin bu handikabı aşılması gereken bir problemdir. Bu doktora tez çalışması kapsamında, kenevir tohum proteinlerinin fonksiyonel özelliklerinin geliştirilmesi için fiziksel (ısıl olmayan) ve kimyasal modifikasyon tekniklerinin tekil ve kombine kullanımının etkinliği üzerine odaklanılmıştır. Çalışmada ülkemizdeki ilk tescilli kenevir tohum çeşidi olan "Narlısaray" kullanılarak bu çeşidin tekno fonksiyonel özelliklerinin uluslararası literatüre girmesi sağlanmıştır. Fiziksel tekniklerden; ultrases homojenizasyon (USH), yüksek basınç homojenizasyon (YBH), manotermosonikasyon (MTS) ve kimyasal tekniklerden; pH değiştirme uygulamasına dair bulgular iki ayrı bölümde ayrıntılı şekilde sunulmuştur. Isıl olmayan teknikler; yenilikçi, güvenli, verimli ve yeşil uygulamalar olarak bilinmektedir. Enzimatik ve ısıl uygulamaların yüksek maliyet ve proses kontrol zorlukları fiziksel tekniklerin önemini arttırmaktadır. Kavitasyon temelli USH, HPH ve MTS uygulamalarının ısıtma, dinamik çalkalama, kayma gerilmeleri ve türbülans gibi etkileri protein süspansiyonlarında çeşitli modifikasyonlara yol açabilmektedir. Özellikle yurtdışında kullanılan dünyadaki tek sürekli sistemde çalışan MTS cihazı, USH teknolojisinin basınç ve sıcaklık uygulamasıyla birleştirildiği bir teknolojiyi yansıtmaktadır. USH uygulamasının tek başına kullanılması proteinlerde istenilen değişikliği sağlayamazken, kombine sistemlerle bu sorun aşılabilmektedir. Ayrıca USH uygulamasının modifikasyon verimini artırmak için 15–30 dakikaya kadar uzayan işlem süresi, enerji ve zaman tüketiminin yanı sıra endüstride uygulanabilirliğini de azaltmaktadır. MTS sisteminin kullanımı ile aynı etkiyi sağlayacak olan işlem süresinin 1,4 dakikaya kadar düşme potansiyeli bulunmaktadır. MTS uygulanmasındaki ılımlı sıcaklık ve basınç kombinasyonu kavitasyonel etkileri teşvik edici olabilmektedir. Aynı zamanda pH değiştirme bu fiziksel uygulamalara kolayca uyarlanarak, uygulama yapılan proteinlerin modifikasyonu üzerindeki etkinin artmasına katkı sağlayabilmektedir. Tez çalışmasının bir kısmı Türkiye'de ve bir kısmı Amerika'da gerçekleştirildiği ve farklı kenevir tohumları kullanıldığı için çalışma iki bölüme ayrılmıştır. Tez çalışmasının birinci bölümünde, USH uygulamasının KTP'nin fonksiyonel, fizikokimyasal, morfolojik ve biyoaktif özellikleri üzerine etkisi incelenmiş, bu uygulamanın KTP'nin özelliklerini modifiye etme potansiyeli ortaya koyulmuştur. Öncelikle, USH proses parametrelerinin (genlik, süre, konsantrasyon) KTP'nin çözünürlük ve partikül boyut yanıtları üzerine etkisi belirlenmiştir. USH işleminin optimal proses koşulları, KTP'nin maksimum çözünürlük ve minimum partikül boyut yanıtlarına göre 37 W/cm2 akustik yoğunlukta, 7,8 dakika işlem süresi ve %6,9 protein konsantrasyonu (20 kHz frekansta) olarak belirlenmiştir. Yüksek R2 ve uyum değerleri sunan çözünürlük ve partikül boyut modelleri gerçek analiz koşullarında doğrulanmıştır. Optimum koşullarda USH uygulanan KTP'nin (KTP-USH) elektroforetik profilinde önemli bir değişiklik meydana gelmemiştir, ancak amino asit profili değişmiştir. FT-IR spektrumu, USH uygulaması ile proteinin Amid 1 ve 2 bölgelerindeki kaymaları ortaya çıkarmıştır. USH uygulamasından sonra Amid 1 (1700–1600 cm-1) bölgesindeki pik 1636 cm-1'den 1629 cm-1'e kaymıştır. Amid 1 bölgesindeki bu kayma, USH uygulamasından sonra KTP'nin ikincil yapısındaki değişikliğe işaret etmektedir. KTP'nin Amid 2 bölgesindeki pik ise 1529 cm-1'den 1524 cm-1'e kaymıştır. FT-IR spektrasında, daha yüksek değerlere doğru görülen kaymalar, USH uygulamasından sonra proteinin α-heliks yapıdan rastgele sarmal ve β-sheet yapılarına dönüşmesi ile ilişkilendirilebilir. USH işleminden sonra KTP'nin denatürasyon sıcaklığında artış, denatürasyon entalpisinde ise azalış görülmüştür. USH uygulamasından sonra, KTP'nin çözünürlüğü (%78), serbest SH grup içeriği (%59) ve zeta potansiyeli (%25) artarken, partikül boyutu (%46) azalmıştır. KTP-USH'nin emülsifikasyon, yağ absorpsiyon ve köpük oluşturma özelliklerinin KTP'ye kıyasla arttığı, en düşük jel konsantrasyonunun ise azaldığı saptanmıştır. Ayrıca KTP'nin antioksidan özelliği, USH uygulaması ile %38 oranında artmıştır. Tez çalışmasının ikinci bölümünde YBH ve MTS uygulamaları ve bunların pH değiştirme ile kombine kullanımlarının KTP'nin fizikokimyasal, morfolojik ve fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır. MTS uygulamasının optimum işlem parametreleri KTP'nin en yüksek çözünürlük ve en düşük partikül boyutunu verecek şekilde 50°C, 200 kPa ve 90 s olarak belirlenmiştir. Uygulanan modifikasyon işlemleri sonrasında, KTP'nin ikincil yapısındaki değişim FTIR ve CD verileri ile doğrulanmıştır. Uygulamalar öncesinde KTP'nin ikinci yapı dağılımı %4,5 α-heliks, %37,9 β-sheet, %14,7 β-turn ve %42,9 rasgele sarım olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamalar sonrasında proteinin ikincil yapı dağılımında genel bir eğilim olarak, α-heliks ve β-sheet oranı azalırken, β-turn ve rastgele sarım oranı artmıştır. İkincil yapı formlarındaki değişiklik, α-heliks ve β-sheet formlarından β-turn ve rastgele sarım formlarına olası dönüşleri göstermektedir. Modifikasyon uygulamaları sonrasında pH12MTS için HSP'nin maksimum floresan yoğunluk (FImax) değeri 13768 Au'dan 43268 Au'a yükselmiştir. pH12MTS izolatı diğer izolatlara göre en yüksek floresans yoğunluğuna sahip iken, bunu sırasıyla HPH, MTS, pH12HPH ve pH12 izolatlarının floresans yoğunluk değerleri izlemiştir. KTP'nin maksimum floresan yoğunluğundaki dalga boyu (λmax) değeri 334 nm civarındayken, modifiye edilmiş tüm izolatlar daha uzun dalga boylarına (336 nm) doğru kaymalar göstermiştir. Bu batokromik kayma, proteinin iç kısımlarında gömülü olan triptofan aminoasidinin protein yüzeyine yöneliminin ve sıvı ortamdaki polaritenin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, tüm uygulamalardan sonra izolatların termal davranışı ve XRD kristal yapısının oranı değişerek modifiye edilen KTP'nin daha düzensiz yapılar gösterdiğini kanıtlamıştır. KTP'nin partikül boyutu (365,87 nm), pH12MTS izolatında 112,67 nm'ye kadar düşmüştür. Modifiye edilen izolatların zeta potansiyelleri ve serbest SH grup içerikleri kavitasyonel kuvvetlerin ve pH değiştirme uygulamalarının kombine etkileri sonucu üçüncül yapılarda meydana gelen değişikliklerin kanıtı olarak artmıştır. pH12MTS izolatının çözünürlüğü, uygulama yapılmayan KTP'ye kıyasla %52 oranında artmıştır. Ayrıca, pH12MTS izolatının emülsiyon aktivitesi ve stabilitesi, KTP'ye kıyasla sırasıyla 2,11 ve 2,15 kat artışlarla diğer uygulamalara kıyasla en yüksek değerleri göstermiştir. Ayrıca, modifikasyon işlemleri sonrasında, KTP'nin %84,23 olan sindirilebilirliği pH12MTS uygulamasında %95,46'ya artış göstermiştir. Bu durum, protein agregatlarının makromoleküler yapısında kavitasyonel etkilerle meydana gelen kısmi açılmalar ve kırılan protein-protein arası interaksiyonlarla ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, bu doktora tez çalışması, kenevir tohum proteinlerinin teknolojik özelliklerinin geliştirilmesinde ısıl olmayan ve kimyasal modifikasyon yöntemlerinin önemli rol oynadığını göstermiştir. KTP'nin yapısında hem farklı modifikasyon tekniklerinin ortaya çıkardığı değişimler kıyaslanmış hem de KTP'nin detaylı tekno fonksiyonel profili ortaya koyulmuştur. Proses parametrelerinin farklı fonksiyonel özellikleri maksimize edecek şekilde optimize edilebileceği gösterilmiştir. Fonksiyonel özelliklerde meydana gelen değişimler fizikokimyasal ve morfolojik analizlerle de uygun bir korelasyon sergilemiştir. Özellikle MTS sistemi, klasik USH ve YBH işlemlerine kıyasla daha kısa proses süresi ile daha etkin bir modifikasyon sağlayan, gelecek vaat eden bir teknik olarak görülmektedir. Aynı zamanda kombine pH değiştirme uygulamaları da fiziksel modifikasyonların etkinliğini arttırmıştır. Modifiye edilen KTP'lerin, daha yüksek çözünürlük, emülsiyon, köpük ve jel oluşturma özelliklerine sahip olması, etkin gıda bileşenleri için arzu edilen tekno-fonksiyonel özelliklere sahip bir gıda bileşeni olarak gıda proseslerinde kullanım potansiyeline sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Aynı zamanda, kullanılan USH, YBH ve MTS teknolojileri işlevselleştirilmiş ve katma değerli farklı proteinlerin eldesinde, biyoaktif bileşenlerin kapsüllenmesinde ve biyopolimer ambalaj materyallerinin elde edilmesinde kullanılma potansiyeli söz konusudur.