Klinik Escherichia coli izolatlarında plazmit aracılı kinolon direnç genlerinin araştırılması

Escherichia coli (E. coli) kaynaklı enfeksiyonların tedavisinde kullanılan kinolon grubu antibiyotiklere duyarlık giderek azalmaktadır. Buna bağlı olarak, kinolon dirençli izolatların dünya genelinde daha fazla rapor edildiği görülmektedir. Bakterilerde kinolon direnç gelişimi kromozomal veya plazmit kaynaklı olabilir. Plazmit aracılı kinolon direncinden qnr genleri, aac(6′)-Ib-cr geni ve qepA/oqxAB genleri sorumludur. Kinolonlara duyarlılığı azaltan bu genlerin ayrıca bakterilerde kromozomal mutasyon oluşumunu tetikleyici rol oynadıkları ve bu durumun yüksek düzey kinolon direncine yol açarak tedaviyi zorlaştırdığı belirlenmiştir. Genellikle konjugatif plazmitler üzerinde taşınan bu genlerin bakteriler arasında konjugasyon yoluyla horizontal aktarımının kinolon direncinin hızlı bir şekilde yayılmasında önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Fenotipik testlerle saptanamayan plazmid aracılı kinolon direncinin moleküler tespiti ve prevalansının takibi hastanelerde kinolon direnç yayılımının önlenmesi açısından son derece önemlidir. Bu tez çalışmasında, siprofloksasine dirençli klinik E. coli izolatlarında plazmit aracılı qnrA, qnrB, qnrS ve aac(6')-Ib-cr genlerinin varlığının araştırılması ve bu genlerin konjugatif plazmitler ile taşınıp taşınmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Eylül 2018-Ocak 2019 tarihleri arasında Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi (KAEÜEAH) servis ve yoğun bakım ünitelerinde yatan hastaların klinik örneklerinden izole edilmiş 59 klinik E. coli izolatı Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına'ndan temin edildi. Vitek-2 otomatize sistemi ile identifikasyonu ve antibiyotik direnci tayini yapıldıktan sonra hastane kültür koleksiyonunda saklanmış olan E. coli izolatları, laboratuvarımızda uygun besiyerinde canlandırıldı. İzolatların total DNA'ları elde edildi ve en yaygın plazmid aracılı kinolon direnç genleri olan qnrA, qnrB, qnrS ve aac(6')-Ib-cr'nin varlığı PCR yöntemiyle araştırıldı. İzolatlarda konjugatif plazmitlerin varlığını saptamak ve direnç genlerinin aktarılabilirliğini belirlemek için konjugasyon deneyleri gerçekleştirildi. Çalışılan 59 E. coli izolatının hiçbiri (%100) qnrA, qnrB ve qnrS genlerini taşımazken, 39 (%66,1) izolat aac(6′)-Ib-cr geni için pozitif bulundu. Bu bulgu, aac(6′)-Ib-cr geni taşıyan E. coli izolatlarının, qnr genleri taşıyan izolatlardan önemli ölçüde daha yaygın olduğunu gösteren ulusal ve uluslararası çalışmaların sonuçlarıyla uyumluydu. Konjugasyon deneylerinin sonuçları, 59 E. coli izolatından Ec15, Ec20, Ec22, Ec64, Ec82, Ec87, Ec131, Ec104, Ec117 ve Ec146 olarak anılan 10'unun (%16.9) konjugatif bir plazmit taşıdığını gösterdi. Daha sonra, bu E. coli izolatlarından konjugatif plazmidlerin aktarıldığı E. coli J53-2 transkonjugant hücrelerin antibiyotik duyarlılık paternleri disk difüzyon yöntemi ile araştırıldı. Sonuçlar, her transkonjugant hücrenin fenotipik olarak kendi yaban tip E. coli izolatı ile aynı antibiyotik direnç profilini sergilediğini gösterdi. Son olarak, E. coli izolatlarından E. coli J53-2 transkonjugant hücrelere aktarılan konjugatif plazmitlerde aac(6')-Ib-cr geninin varlığını araştırmak için transkonjugant hücrelerden plazmitler izole edildi ve aac(6')-Ib-cr geni PCR ile çoğaltıldı. Sonuçlar 7 transkonjugant hücrenin aac(6')- Ib-cr pozitif, diğer 3 hücrenin ise negatif olduğunu gösterdi. Antibiyogram ve PCR bulguları birlikte, aac(6')-Ib-cr pozitif Ec15, Ec20, Ec22, Ec64, Ec82, Ec131 ve Ec146 izolatlarında aac(6')-Ib-cr geninin çoklu antibiyotik direnci taşıyan konjugatif plazmitler üzerinde yer aldığını gösterdi. Öte yandan, aac-(6')-Ib-cr negatif Ec87, Ec104 ve Ec117 izolatlarından konjugatif plazmitlerin aktarıldığı E. coli J53-2 transkonjugant hücrelerde fenotipik olarak kinolon direnci saptanmasına rağmen, konjugatif plazmitlerde aac-(6')-Ib-cr geni mevcut değildi. Bu gözlem, bu 3 izolatın konjugatif plazmitlerinin, diğer 7 izolatta bulunan aac-(6')-Ib-cr geninden farklı kinolon direnç geni veya genlerine sahip olduğunu düşündürdü. Gerçekleştirilen bu tez, hastanemizde enfeksiyona neden olan klinik E. coli izolatlarında plazmit aracılı kinolon direncinin kapsamlı olarak araştırıldığı ilk çalışmadır. Sonuçlar, plazmit aracılı aac(6′)-Ib-cr genini içeren izolatların prevalansının oldukça yüksek (%66,1) olduğunu göstermiştir. Ayrıca aac(6′)-Ib-cr geninin bazı izolatlarda konjugatif plazmitler üzerinde çoklu antibiyotik direnç genleriyle birlikte taşındığısaptanmıştır. Çoklu antibiyotik direnç geni taşıyan konjugatif plazmitler içeren izolatların varlığı, hastanemizde E. coli enfeksiyonlarının tedavi seçeneklerini sınırlayabilecek önemli bir sorundur. Son olarak çalışmamız, enfeksiyöz mikroorganizmaların antibiyotik direnç profillerinin belirlenmesinde fenotipik testlerin yanı sıra genotipik testlerin de kullanılmasının faydalı olacağını vurgulamaktadır. Anahtar Kelimeler: E. coli, PCR, Plazmid aracılı kinolon direnci (PMQR), Konjugatif plazmit, qnrA, qnrB, qnrS, acc-6'-Ib-cr