Klinik örneklerden izole edilen çoğul dirençli klebsiella pneumoniae izolatlarında CRISPR-CAS sistemi ile gen düzenlemesinin yapılması

Bu çalışmada İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda klinik örneklerden izole edilen çoğul dirençli Klebsiella pneumoniae izolatlarında gen düzenlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya Haziran-Eylül 2020 tarihleri arasında izole edilen beş tane çoğul dirençli K. pneumoniae izolatı dahil edilmiştir. Bu izolatlarda imipenem, meroperem ve ertapenem için minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerleri, EUCAST önerilerine göre sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle saptanmıştır. Klasik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle izolatların blaOXA-48, blaNDM-1 ve blaCTX-M-15 genlerinin varlığı araştırılmıştır. CRISPR-Cas sisteminde kullanılmak üzere ikili plazmid ( CRISPR-Cas9 ve CRISPR destekli sitidin deaminaz) tasarlanmıştır. Transformasyonda plazmidlerin seçiliminde kullanılacak antibiyotiklerin izolatlara duyarlılıkları araştırılmıştır. Ana vektörü oluşturmak için K. pneumoniae plazmitlerinden (pCasKP-apr, pCasKP-hph, pSGKP-km, pSGKP-spe, pBECKP-km, pBECKP-spe) hedeflenen gen bölgeleri (AmpR (Pro), AraBAD, ApmR, Cas9 ve Cas9 (D10A)-APOBEC1) PCR yöntemi ile çoğaltılmıştır. Klonlama, ligasyon ve TEDA (T5 ekzonükleaz DNA ekleme) yöntemi ile yapılmıştır. İzolatların MİK değerleri imipenem için 4-128 µg/mL, meropenem için 8-64 µg/mL ve ertapenem için 8-256 µg/mL aralığında saptanmıştır. İzolatların tümü ertapeneme, meropeneme ve imipeneme dirençli bulunmuştur. İzolatlarının tamamında (n=5) blaOXA-48 benzeri ve blaCTX-M-15 genleri, bir izolatta (%20) blaNDM-1 geni saptanmıştır. Her bir direnç geninin dizi analizi sonuçlarına göre ayrı ayrı gRNA dizileri oluşturulmuştur. İzolatlar, transformasyon aşamasında kullanılacak antibiyotiklerden yalnızca apramisine (50 µg/mL) duyarlı bulunmuştur. CRISPR-Cas sisteminde kullanılmak üzere tasarlanan ana vektöre Cas9 ve APOBEC bölgeleri klonlanamamış ancak pSGKP-AmpR (Pro)-AprR plazmiti başarılı bir şekilde oluşturulmuştur. Sonuç olarak, antibiyotiklere çoğul dirençli K. pneumoniae izolatlarında CRISPR-Cas sisteminin kullanılarak gen düzenlemesinin yapılabileceği, bu çalışmanın ülkemizden yapılan ilk çalışma olduğu, daha fazla ve ileri çalışmalar ile desteklenerek, dirençli bakterilerde antibiyotik tedavilerine alternatif bir çözüm olabileceği öngörülmektedir.