Development of methods for identification and characterization of autologous antibody responses in small cell lung cancer and Behcet's disease

Behçet Hastalığında (BH) ve Küçük Hücreli Akciğer Kanseri'nde (KHAK) otolog antikorların geliştiği bilinmektedir. KHAK akciğer kanser hastalarının %15-20 sini oluşturmaktadır. En agresif akciğer kanseri tipi olup genellikle son evrelerde teşhis edilmektedir. Ortalama yaşam süresi 9-12 aydır. Akciğer kanseri teşhisinde bilgisayarlı tomogrofi ve PET kısmen yararlı olsa da tümör hücrelerinin iki katına çıkma süresi çok hızlı olan KHAK için bu yöntemlerin kullanılması uygun gözükmemektedir. Bu yüzden yaşam süresini arttırmak ve erken teşhisi sağlayabilmek için yeni teşhis yöntemleri gereklidir. Behçet Hastalığı otoimmün bir hastalıktır ve dünyada Behçet Hastalığın görülme sıklığı en yüksek olan ülke Türkiye'dir. BH ile ilişikili çeşitli antijenlere karşı gelişen otolog antikorlar BH'da keşfedilmiştir. BH'nın ağız, deri, vasküler ve nöronal alt grupları bulunmaktadır. Alt grupları ile ilişki otolog antikolar daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak BH için prognostik ve diyagnositk kitler geliştirilmemiştir. KHAK ve BH'ının teşhisi ve takibi için otoantikorlardan faydalanılabilinir. Çünkü otoantikolar hastalık semptomları ortaya çıkmadan üretildikleri bilinmektedir. Bu çalışmanın ilk amacı tumör dokularında antijen ifade seviyesi ile otolog antikorların varlığı arasında ilişkiyi belirlemekti. İkinci amacı KHAK ve BH'nda bilinen ve yeni keşfedilmiş antijenlere karşı üretilen otolog antikoların tespiti ile ilgili önceden yapılmış deneyleri geliştirmek olmuştur. Üçüncü ve ana hedefimiz ise protein array tarama sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılacak hassas ve güvenilir bir metot geliştirmek ve ELISA ve Western Blot deneyleriyle de sonuçları doğrulamaktır. Protein Arrayler (PA) 50 KHAK, 50 BH ve 50 sağlıklı serumlarıyla laboratuvarımızda diğer araştırmacılar tarafından taranmış ve görsel olarak otomatikleştirilmiş metotlar kullanılmadan değerlendirilmiştir. Hassasiyet ve özgüllük değerleri antijen panelleri oluşturularak hesaplanmıştır. Antijenlerin doğrulanması için ELISA deneyleri yapılmıştır. Ancak önceki ELISA ve protein array deney sonuçları birbirine göre oldukça farklıdır. ELISA deney sonuçlarının tutarsız olmasından dolayı ELISA deney koşullarının optimize edilmesi gerekmektedir. Ayrıca PA'de sinyallerin numerik değerlere dönüştürübilen otomatikleştirilmiş PA değerlendirme metodu geliştirilmelidir. Tutarlı sonuçlara ulaşana kadar ELISA deneyi parametreler değiştirilerek modifiye edilmiştir. PA tarama sonuçlarından antikor varlığı ile ilişkili sayısal değer oluşturabilen güvenilir PA değerlendirme metodu geliştirilmiştir. Metodun çalışması PA de bulunan reaktif klonların piksel yoğunluklarının hesaplanmasına dayalıdır. Sağlıklı ve hasta serum taramalarından elde edilen sonuçların karşılaştırılmasıyla antikor yanıtlarının hassasiyet ve özgüllük değerleri hesaplanmıştır. Bu yönteme" Dijital Spot Değerlendirmesi" (DSD) adı verilmiştir. DSD Adope Photoshop CS6 programı alt yapısına dayalı çalışmaktadır. Programdaki parametreler 1 serum için 5 tarama yapılarak optimize edilmiştir. Tekrar deneylerinin Pearson's r korelasyon değerleri 1'e yakındır. Ayrıca farklı günlerde farklı araştırmacılar tarafından taranan PA'lerin DSD programı ile değerlendirilme sonuçları oldukça uyumludur. DSD programı kullanılarak KHAK kanseri ve sağlıklı sera taramaları değerlendirilmiştir. SOX2, p53 ve POLB proteinlerine karşı gelişen antikor yoğunlukları değerlendirilmiş hassasiyet/özgüllük değerleri hesaplanmıştır. DSD değerlendirme sonuçlarına göre SOX2, p53 ve POLB proteinleri için sırasıyla %100 özgüllükte, %44, %6 ve %20 hassasiyet değerlerine ulaşılmıştır. 3 proteinin panel olarak birlikte değerlendirilmesiyle %100 özgüllükte %56 hassasiyete, %96 özgüllükte %66 hassasiyete çıkmaktadır. Ancak optimizasyon yapıldıktan sonra bile, ELISA sonuçlarıyla SOX2, p53 ve POLB proteinleri için sırasıyla %100 özgüllükte, %32, %4 ve %4 hassasiyet değerleri elde edilmektedir. Sonuçlarımız DSE'nin ELISA yöntemine göre daha hassas olduğunu göstermektedir. Bu nedenle gelecekte diğer tümör tipleri ve BH için taranmış PA'lerin hepsi DSE yöntemiyle değerlendirilmesi, KHAK ve BH'nın teşhisi ve takibi için de DSE yöntemi kullanılması prensibiyle çalışacak kit geliştirilmesi planlanmıştır.