LZTR1'in Hep3B hepatoselüler karsinom hücre hattındaki transkripsiyonel etkilerinin araştırılması

Karaciğer kanseri, dünyada en sık teşhis edilen kanser tipleri arasında yedinci, kansere bağlı ölüm nedenleri arasında üçüncü sıradadır. Primer karaciğer kanserlerinin, %85'ini hepatoselüler karsinom (HCC) oluşturmaktadır. Leucine zipper like post translational regulator 1 (LZTR1) geni tarafından kodlanan LZTR1 proteini, hücre içinde kanonik RAS ve kanonik olmayan RIT1 proteinlerini poliubikitinleyerek RAS/ mitogen activated protein kinase (RAS/MAPK) sinyalininin azalmasında rol oynar. LZTR1'in HCC'de sıklıkla mutasyona uğradığı ve tümör baskılayıcı olduğu tespit edilmiştir. LZTR1'in nakavt edilmesinin HCC hücrelerinde neden olduğu transkripsiyonel değişiklikler araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında, Hep3B hücre hattında LZTR1'in nakavt edilmesinin ekspresyonel değişiklikler üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda CRISPR/Cas9 yöntemiyle LZTR1 geninin nakavt edilmesi, LZTR1 nakavt ve kontrol hücrelerin RNA örnekleriyle karşılaştırmalı transkriptomik analizler yaparak Hep3B hücrelerinde LZTR1 geninin yol açtığı ekspresyon değişikliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak LZTR1'in nakavt edildiği ve edilmediği Hep3B kolonileri hazırlandı. LZTR1 protein seviyeleri western blotlama yöntemiyle ve genomik DNA dizileri Sanger yöntemiyle analiz edilerek, LZTR1 nakavtı doğrulanmıştır. RNA dizileme analizlerinin sonucunda, LZTR1'in nakavt edilmesi 20'si LncRNA olmak üzere 117 genin ifadesini >1.5 kat (p<0.05) değiştirdiğini ortaya koymuştur. Gen seti zenginleşme analizleri (GSEA), LZTR1 ifade edildiğinde gelişim ve farklılaşma, transkripsiyon düzenleme ve hücre sinyal iletimi biyolojik süreçleriyle ilişkili Gene Ontology (GO) terimlerinin zenginleştiğini ortaya çıkardı. qRT-PCR yöntemiyle yaptığımız validasyon deneylerinin sonuçları, RNA dizileme sonuçlarıyla uyumlu olarak (R2: 0.96) cadherin 11 (CDH11), tribbles pseudokinase 2 (TRIB2) ve KLF transcription factor 5 (KLF5) gen ekspresyonlarının LZTR1 nakavt hücrelerde arttığını, vimentin (VIM), angiomotin like 1 (AMOTL1), bone morphogenetic protein 7 (BMP7) ve reelin (RELN) gen ekspresyonlarının ise azaldığını gösterdi. Bu tez çalışmasının sonucunda LZTR1'in HCC'deki transkripsiyonel düzenleyici işlevlerinin aydınlatılmasına katkı sağlayacak veriler elde edilmiş olup, bu bulguların LZTR1'in HCC'deki rolünün daha iyi anlaşılmasına fayda sağlayabileceği öngörülmektedir.