Madımak bitkisindeki fenolik asit ve flavonoidlerin HPLC-DAD yöntemiyle tayini, biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi

Polygonaceae ailesine ait Madımak (Polygonum cognatum Meissn.) ülkemizde kendiliğinden yetişen çok yıllık bir bitkidir. Bu bitki fenolik içerik bakımından zengindir. Fenolik bileşikler, bitkilerin en önemli sekonder metabolit grubunu oluştururlar ve bu bileşiklerin antioksidan, antimikrobiyal ve antikanserojen aktivitelerinin olduğu bilinmektedir. Hassasiyeti, doğruluğu ve kısa analiz süresinden dolayı yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), fenolik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif tayininde kullanılan en popüler analitik yöntemlerdendir. Bu tez çalışmasında farklı zamanda ve farklı bölgelerden hasat edilen madımak bitkisinin antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik aktiviteleri incelenmiştir. Bitkideki 10 fenolik bileşiğin (protokateşik asit, kateşin, gentisik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, polidatin, kumarin, resveratrol, ellajik asit, kuersetin) eş zamanlı kalitatif ve kantitatif tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Sivas (A bitkisi) ve Ordu (B bitkisi) illerinden toplanan ve soxhlet yöntemiyle ekstrakte edilen madımak bitkilerinin antioksidan aktivitesi DPPH yöntemiyle belirlenmiştir. Bitki ekstraktların IC50 değerleri A ve B bitkisi için sırasıyla, 0,781 mg/mL ve 0,657 mg/mL olarak saptanmıştır. Antimikrobiyal aktivite difüzyon ve dilüsyon yöntemiyle araştırılmıştır. Nokta-damlatma ekim yönteminde ham ekstrakt mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonu oluşturmamıştır. Metanol ekstraktı en güçlü antibakteriyal aktiviteyi Gram negatif bakterilerden 23 mm inhibisyon zonu ile Escherichia coli bakterisine; 20 mm inhibisyon zonu ile Gram pozitif bakterilerden Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisine; en güçlü antimikrobiyal aktiviteyi 25 mm inhibisyon zonu ile Candida albicans mantarına karşı göstermiştir. Ham ekstraktın tüm derişimlerinde üreme görülmüş, metanol ekstraktında MİK değerleri tüm mikroorganizmalar için 4,75 mg/mL olarak saptanmıştır. MBK değeri Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisi için 5,00 mg/mL, diğer tüm mikroorganizmalar için için 4,75 mg/mL olarak belirlenmiştir. Sitotoksik aktivitenin tayinini L929 ve SAOS-2 hücre hatları üzerinde MTT yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. L929 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %160,182-%121,992 ve %156,997-135,546 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitki ekstraktlarının negatif kontrole göre proliferatif etkisi gözlemlenmiştir. SAOS-2 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %111,341-63,492 ve %137,141-%99,483 aralığında saptanmıştır. A bitki ekstraktının negatif kontrole göre antiproliferatif etkisi gözlemlenirken; B bitki ekstraktının ise sadece 10 mg/mL derişimde antiproliferatif etkisi gözlemlenmiştir. Fenolik bileşiklerin eş zamanlı tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiştir. Kromatografik tayinler SUPELCOSIL LC-18 (25cm x 4,6mm, 5µm) kolonunda gradient program ile gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, akış hızı ve kolon sıcaklığı optimize edilmiştir. Geliştirilen yöntemin validasyonunda sistem uygunluğu araştırılmış ve geliştirilen yöntemin önerilen değerlere uygun olduğu saptanmıştır. LOD ve LOQ değerleri sırasıyla, 0,051- 0,188 µg/mL ve 0,169- 0,628 µg/mL aralığında hesaplanmıştır. Gün içi analizlerde % geri kazanım 99,273-101,032 ve %RSD 0,090-0,652; günler arası analizlerde % geri kazanım 99,017-101,983 ve %RSD 0,059-0,697 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitkilerinde en yüksek miktarda resveratrol; en düşük miktarda kafeik asit tayin edilmiştir. Her iki bitki ekstraktında gentisik asit bileşiğine rastlanmamıştır.