Unfolded protein response regulated miRNAs in lipotoxic endoplasmic reticulum stress in macrophages

Hücrenin düzgün çalışması ve gelişimi, çok hücreli organizmalar için en temel gereksinimlerden biridir – hücre mekanizmalarındaki herhangi bir düzensizlik birçok hastalığın oluşumuna ya da ölüme neden olabilmektedir. Bu sağlık problemleri arasında, obezite, diyabet ve ateroskleroz gibi metabolik hastalıkların oluşumundaki küresel artış günümüzde önemli bir araştırma konusu oluşturmaktadır. Metabolik hastalıkların gelecek on yıl içinde hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde daha da yaygın hale geleceği beklendiği için bu hastalıkların oluşumunda etkili olan hücresel mekanizmaların daha iyi anlaşılması, bu tehlikeli hastalık grubuna karşı yeni ve etkili tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi adına, önemli bir öncelik haline gelmektedir. Sağlık için önemli olan homeostatik hücre yolakları arasında Katlanmamış Protein Yanıtı (KPY) fungilerden memelilere kadar evrimsel olarak korunmuş bir mekanizmadır. En korunmuş KPY dalı olan Inositol-requiring protein-1 (IRE1) dışında memeli KPY'si IRE1, eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (PERK), and activating transcription factor 6 (ATF6) tarafından kontrol edilen üç koldan oluşmaktadır. KPY mekanizması katlanmamış ya da yanlış katlanmış proteinlerin endoplasmic reticulumda (ER) birikimi ile oluşan ER stresine yanıt olarak etkin hale geçmektedir. KPY'nin amacı protein üretimini durdurarak ve protein katlanmasını arttırarak ER homestazını tekrar sağlamaktır. Çözülemeyen ER stresi durumlarında ise KPY hücreyi programlanmış hücre ölümüne yönlendirmektedir. Yeni araştırmalar microRNA (miRNA) gibi kodlanmayan RNAların KPY mekanizmasının alt ve üst basamaklarında önemli rolleri olduğunu göstermektedir. Bu tezde, lipid tarafından oluşturulan ER stresin etkisi altındaki makrofajlarda miRNA ifadesinin farklı KPY kolları tarafından düzenlenmesi incelenmektedir. Doymuş yağ asidi, palmitat ile strese sokulmuş RAW 264.7 fare makrofajlarından elde edilen RNA ile yapılan PCR array sonuçunda, birçok farklı ifade edilen miRNA ortaya çıkarmıştır. Farklı KPY kollarının, bu miRNAlar arasından en fazla değişim gösterenlerin adaylar üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bunun için çeşitli deney yaklaşımları kullanılmıştır. Öncelikle, PCR array sonuçlarından en anlamlı değişim gösteren miRNAlar incelendi. KPY kollarının doymuş yağ asitleri ile kontrol edilen miRNAlar üzerindeki etkisini incelemek için, macrofajlara IRE1 ve PERK silencer RNA (siRNA) ile transfekte edildikten sonra palmitat uygulandı ve alakalı genlerin ifadesi palmitat uygulanmış makrofajlarda ölçüldü. Alternatif bir method olarak palmitat, IRE endoribonükleaz ve PERK kinaz inhibitörleri ile birlikte uygulandı. Ayrıca miRNAların IRE1 endoribonükleaz tarafından regule edildiğini kanıtlamak için IRE1 ifade etmeyen fare embroyonik fibroblast (MEF) hücre hatlarında fonksiyonel ve endoribonükleaz aktivitesini kaybeden IRE1 mutantı ifade edildi. Sonuç olarak, palmitata bağlı miR-2137 artışının IRE1 endoribonukleaza bağlı olduğu belirlendi. Daha sonra miR-2137'nin potansiyel mRNA hedefleri miR-2137'yi yüksek oranda ifade ederek ya da inhibe ederek araştırıldı ve inositol polyphosphate phosphatase-like 1 (Innpl1) olası bir hedef olarak belirlendi. miR-2137'nin dışında, palmitat uygulanan makrofajlarda miR-33 de anlamlı bir değişim gösterdi. miR-33'ün ateroskleroz, obezite ve insülin direncindeki etkisi daha önce gösterildiği için, miR-33 ifadesi IRE1 ve PERK siRNA transfekte edilmiş RAW 264.7 fare makrofaj hücre hattında ve kemik iliğinden elde edilmiş primer makrofajlarda incelendi. miR-33'ün bilinen bir hedefi olan ABCA1'nın ifadesi de kontrol edildi ve IRE koluna bağlı değişim gösterdiği doğrulandı. Araştırmamızın sonuçları makrofajlarda yağ asidinin yarattığı stres sırasında KPY tarafından düzenlenen yeni microRNAlar olduğunu göstermektedir. Fazla oranda yağ; ateroskleroz, obezite ve insülin direnci gibi metabolik hastalıkların birincil nedenlerinden biridir. Bulduğumuz miRNAlar KPY'nin miRNA üzerinden rolünü gösterip, bu hastalık grubunun oluşumunun ardında yatan mekanizmaları açıklayabilir. Ayrıca, bu miRNA'ların bu tip rahatsızlıkların oluşumunda etkili olabileceğini düşündüğümüz hedeflerini gösterdik. İlerideki araştırmalar tam mekanizmayı açıklayıp, yeni terapatik yöntemlerin gelişmesine yol açabilecektir.