N-asetil sistein, rifampisin ve ozonun panrezistan Klebsiella pneumoniae izolatlarının oluşturduğu biyofilm üzerine etkinliği

Amaç ve Giriş: Bu çalışmada giderek çözümü zor hale gelen ve hastanemizde de önemli bir nozokomiyal infeksiyon etkeni olarak karşımıza çıkan panrezistan Klebsiella pneumoniae (PRKp)'nin neden olduğu infeksiyonlar ve direnç sorununa çözüm aranmaya çalışılmıştır. Yeni bir antibiyotikle şimdilik çözüm yolu olmadığı bilindiği için biyofilm tabakası hedef alınarak biyofilm tabakasına etkili olması beklenen N-asetil sistein (NAC), rifampisin ve ozon gibi antibiyofilm etkinlikli ajanların uygulanması ve etkili olmaları durumunda tedavide kullanılabilecek antibiyotiklerin etkili olabilmesi ve infeksiyonun tedavi olabilirliğini sağlaması beklenmektedir. Gereç ve Yöntemler: İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesi'nde 15 Haziran 2017- 15 Temmuz 2018 tarihleri arasında yatan, >18 yaş üstü dokuz hastadan alınan örneklerde invazif infeksiyon oluşturmuş K. pneumoniae izolatları klasik biyokimyasal yöntemler kullanılarak tanımlandı. Bu bakterilerin antibiyotiklere duyarlılıklarının belirlenmesinde kullanılan disk difüzyon yöntemi, gradyan testi ve sıvı mikrodilüsyon yöntemleri için European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) tarafından belirlenen zon çapları ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri kullanıldı. Bakterilerin biyofilm oluşturma yeteneklerinin gösterilmesi için mikroplakta kristal viyole boyama yöntemi kullanıldı. Kuyucukların optik dansiteleri (OD) ölçülerek biyofilm oluşturma kapasitelerine göre sınıflandırma yapıldı. Tek tabaka hücre kültüründe hücre içi biyofilm oluşturma yeteneği belirlendi. Biyofilm oluşumu ve NAC, rifampisin ve ozonun biyofilm tabakası üzerine etkinliği koloni sayma yöntemi ve lazer taramalı konfokal mikroskopisi yöntemiyle gösterildi. Bulgular: Çalışmaya dokuz hasta dahil edildi. Bu hastalardan 5 (%55.5)'i Yoğun Bakım Ünitesi'nde yatmaktaydı. Hastaların dördü bakteriyemi, üçü ventilatörle ilişkili pnömoni (VİP), biri protez infeksiyonu, diğeri ise komplike idrar yolu infeksiyonu tanısıyla takip edildi. PRKp infeksiyonu gelişen hastaların altısı meropenem, tigesiklin ve kolistin; ikisi imipenem, tigesiklin ve kolistin; biri ise meropenem, ertapenem ve kolistin kombinasyonuyla tedavi edildi. Hastanede kalış süresi ortalama 50.4 (4-80) gündü. Tedavi başlandıktan ortalama dokuz gün (4-21) sonra hastalardan 7 (%77.7)'si geniş spektrumlu antibiyotik kullanılmasına karşın kaybedildi. Hayatta kalan hastalardan birisi komplike idrar yolu infeksiyonu tanısıyla meropenem, ertapenem ve kolistin tedavisi alan ve sondası değiştirilen hasta; diğeri ise protez infeksiyonu tanısıyla meropenem, tigesiklin ve kolistin tedavisi alan ve protezi değiştirilen hastaydı. İzolatların tüm antimikrobiyal kategorilerde tüm ajanlara dirençli oldukları gösterildi ve hepsi denenen tüm antibiyotiklere dirençli bakteri (PDR) olarak tanımlandı. Karbapeneme dirençli olan suşların hepsinde (%100) genotipik yöntemlerle karbapenemaz geni saptandı. Tüm suşlarda saptanan karbapenemaz tipi OXA-48 idi, sadece bir suşta (12 no'lu) hem OXA-48 hem de NDM-1 geni birlikte saptandı. Biyofilm oluşumu yönünden tüm K. pneumoniae suşları değerlendirildiğinde biyofilm yapanların oranı %100 olarak saptandı. Pozitif ve negatif kontrole göre yapılan sınıflandırmada izolatların hepsinin (%100) yüksek düzeyde biyofilm oluşturduğu belirlendi. Koloni sayma yöntemiyle, biyofilm oluşturmuş (24 saatlik) bakterilere son konsantrasyon 2 g/ml ve 0.1 g/ml olacak şekilde NAC ve rifampisin uygulanarak 2. saat, 6. saat, 24. saat ve 72. saatlerdeki etkileri incelendi. Kullanılan tüm izolatlarda ortalamalarına bakılarak kendi kontrollerine göre bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı (sırasıyla NAC için p değeri >0.05, >0.05, >0.05, >0.05 ve rifampisin için p değeri >0.05, >0.05, >0.05, >0.05). Son konsantrasyon 0.6 g/ml olacak şekilde ozonlu su uygulandığında belirlenen zamandaki kendi kontrollerinin ortalamalarına göre 6. ve 24. saatte bakteri sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma görülmekle (sırasıyla p değeri <0.05, <0.05) birlikte logaritmik olarak 2 log10 veya üzerinde bir azalma saptanmadığı için etkili olmadığı düşünüldü. Bununla birlikte, 2. ve 72. saatteki incelemede biyofilmdeki bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı (sırasıyla p değeri >0.05, >0.05). Sudaki ozon konsantrasyonu artırılarak son konsantrasyon 4.78 g/ml olacak şekilde ozonlu su uygulandığında 2. ve 24. saatte biyofilmdeki bakteri sayısında istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmekle (sırasıyla p değeri <0.05, <0.05) birlikte 2 log10 üzerinde azalma saptanmadığı için etkili olmadığı düşünüldü. Bununla birlikte, aynı konsantrasyonda 6. saatte istatistiksel olarak anlamlı bir azalma görülmedi. Ancak, 72. saatteki incelemede biyofilmdeki bakteri sayısında tüm izolatlarda 2.06-4.08 log10 aralığında azalma saptandığı için etkili olarak değerlendirildi. Lazer taramalı konfokal mikroskopi yöntemiyle, biyofilm oluşturmuş (24 saatlik) bakterilerde son konsantrasyon 2 g/ml, 0.1 g/ml ve 4.78 g/ml olacak şekilde NAC, rifampisin, ozonlu su uygulandığında 2., 6. ve 24. saatlerdeki biyofilm içindeki canlı ve ölü bakteriler üzerine etkileri incelendi. Tüm izolatlarda kendi kontrollerine göre bakteri sayısında 24. saatte ozonlu suda istatistiksel olarak anlamlı azalma (canlı bakteriler için p değeri 0.05 ve ölü bakteriler için p değeri 0.01) dışında canlı ve ölü bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı. Bununla birlikte logaritmik olarak 2 log10 veya üzerinde bir azalma gösterilmediği için ozonlu suyun koloni sayma yöntemiyle belirlendiği gibi 24. saatte de etkili olmadığı düşünüldü. Sonuç: PRKp izolatları ülkemizde ve dünya çapında tedavi açısından sorun oluşturan önemli bir patojendir. OXA-48 ve NDM tipi karbapenemaz üreten ve özellikle Yoğun Bakım Ünitesi hastalarında kolonize olan bu bakteriler hastanemizde endemik hale geçmişlerdir. Ancak, bu izolatların biyofilm oluşturma yetenekleri hakkında bir veri yoktur. Bunun dışında, literatür taraması yapıldığında panrezistan suşlarla ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. PRKp'nin biyofilm oluşturma özelliğini karakterize etmenin yanı sıra, biyofilm oluşturan bu izolatların tedavisinde kullanılacak farklı yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Böyle dirençli suşların tedavisinde NAC (2 mg/lt), rifampisin (0.1 mg/lt) ve ozon (0.6 mg/lt ve 4.78 mg/lt) gibi diğer ajanların belirli konsantrasyonlarda etkinliği ilk defa bu çalışmada test edilmiştir. Test sonuçlarına göre NAC ve rifampisin etkili bulunmamakla birlikte, ozon 4.78 mg/lt konsantrasyonda bile bakteri sayısında ≥2 log10'luk azalmayı sağlamıştır. Daha yüksek ozon konsantrasyonunun kullanılması durumunda tedavi açısından başarılı sonuçların alınabileceği düşünülmektedir. Daha fazla suşla in vitro testlerin yapılmasının yanı sıra in vivo deneylerle de bu antibiyofilm etkinlikli ajanların etkinliklerinin gösterilmesi gerekmektedir. Ayrıca, bakterilerin hem biyofilm oluşturma kapasiteleri hem de panrezistan olmaları nedeniyle halihazırda kullanılacak tedavi seçeneklerinin bulunmaması, bu infeksiyonların gelişimini önlemenin yani hastane kontrol önlemlerinin önemini iyice vurgulamaktadır. Anahtar kelimeler: Panrezistan Klebsiella pneumoniae, biyofilm, N-asetil sistein, rifampisin, ozon