SERS ile bakteri tanısında nanobiyo-yaklaşımlar

Besin ve su kaynaklı hastalıklar tüm dünyada çok ciddi ve maliyetli halk sağlığı sorunları arasındadır. Besin ve sularda patojenik bakteriyel kirliliğin izlenmesi/ erken tanısı global olarak en önemli öncelikli biridir. Bu doktora çalışmasının temel amacı patojenik bakterilerin tanısı/aydınlatılması için nanobiyo-esaslı protokolların geliştirilmesidir. Escherichia coli (E.coli) temel hedef bakteridir, ancak karşılaştırma yapmak üzere çalışmaya Staphylococcus aureus (S.aureus) and Salmonella infantis (S.infantis) de ilave edilmiştir. Bu bakteriler ve özgün bakteriyofajları Türkiye ve Gürcistan'daki (Eliava Institute, Tiflis) uzman enstitülerden/ laboratuvarlardan ve Amerikan Doku Kültür Kolleksiyonundan (ATCC) temin edilmiş, laboratuvarlarımızda çoğaltılmış, karakterize edilmiş ve kullanılmıştır. Bakteri kültürleri her çalışma günü için stoklardan taze olarak hazırlanmıştır. Bakteri ve fajları başlangıç konsantrasyonları tez kapsamındaki çalışmalarda, sırasıyla 108 CFU/mL and 108 PFU/mL dir. Optik sinyallerin zenginleştirilmesi için 3 farklı plasmonik nanopartikül - gümüş nanoküreler (AgNPs), altın nanoküre ve nanoçubuklar (AuNPs ve AuNRs) sentezlenmiştir. Farklı boyda nanopartikül üretmek için indirgeme ajanı ve nanoemülsiyonların kararlılığını artırmak için sitrat ve/veya CTAB kullanılan farklı yöntemler uygulanmıştır. Bunlar SEM/TEM, Zeta-Sizer, UV-spektrofotometre, LSPR ve AFM kullanılarak karakterize edilmiştir. Seçilen türler aşağıda verilen uygulamalarda kullanılmıştır. Bu tez kapsamında bakteri tanısı ve aydınlatılması amacıyla - temel olarak "Yüzey Zenginleştirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS)" tekniği uygulanmıştır. Bakteriyofajların özgün biyoproblar ve nanopartiküllerin sinyal güçlendiriciler olarak yer aldığı bu çalışmalarda alternatif uygulama protokolleri geliştirilmiştir. SERS çalışmaları önce farklı taşıyıcılar, cam slaytlar ve onların polidopamin kaplı formları ve silika kullanılmıştır. Platformlara ait SERS pikleri bakteri/faj piklerinin üzerini örtmediği silika slaytlar başarılı bulunmuş ve sonraki çalışmalarda yalnızca bu yüzeyler kullanılmıştır. İki grup tanı çalışması yapılmıştır. Birinci grupta önce nanopartiküller silika yüzeylere biriktirilmiş, daha sonra hedef bakteri/bakteriyofajlar yüzeye sırasıyla konularak SERS verileri toplanmıştır. Özellikle fajların konulmasından sonra spektrumlardaki değişimlerin çok belirleyici tanı protokolu oluşturulmasını sağladığı not edilmiştir. İkinci grupta, bakteriler önce süspansiyonda altın nanoçubuklar ile inkübe edilmiş ve nanoçubukların bakteri yüzeyine yığılmaları sağlanmıştır. Daha sonra bu karışım silika yüzeylere damlatılmış ve bakterilere odaklanarak SERS verileri toplanmıştır. Hedef bakterilerinin belirgin ve güçlü parmak izleri elde edilmiştir. Bu nanoçubuk yüklü bakterilerin bulunduğu slaytların üzerine özgün fajlar damlatılmış ve spektrumların zamanla değişimi izlenmiştir. Fajlara ait pikler güçlenirken bakteriye ait piklerin bir kısmı kaybolmuştur. Tek bir bakteri üzerine dahi hedefleme yapılarak tanımlayıcı belirgin spektral piklerin elde edilmesi mümkün olmuştur. Bu çok ilginç/yenilikçi bulgular burada uygulanan SERS protokolunun başarıyla kullanılabileceğini göstermiştir. Destekleyici olarak yapılan öncü çalışmalarda "Lokalize Yüzey Plazmon Resonans (LSPR) Spektroskopi" ve "Matriks Yardımcı Lazer Desorpsiyon/İyonizayon-Zaman/Uçuş Kütle Spektroskopi (MALDI-TOF MS)" tekniklerinin de kullanılabilirlikleri araştırılmıştır. LSPR çalışmaları polidopamin ile kaplanmış daha sonra AgNPs, AuNPs ve AuNRs lerin biriktirilmesi ile modifiye edilmiş cam slaytlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. AuNPs - küresel şekilleri ve boyutları (yaklaşık 40 nm) nedeniyle en başarılı olarak bulunmuştur. Önce hedef bakteri (E.coli) yüzeylere damlatılmış ve LSPR verileri toplanmıştır. Daha sonra özgün faj taşıyıcı üzerine konmuş ve LSPR'de ki değişiklikler kaydedilmiştir. Bu değişimler hedef bakterileri tanısının LSPR ile başarıyla yapılabileceği gösterilmiştir. Özgün olmayan faj E.coli üzerinde çalışmamış, böylece bu çok basit LSPR tekniği ile özgün tanı yapılabileceği vurgulanmıştır. Son tanı grubunda bir profesyonel MALDI-TOF MS sistemi kullanılmıştır. Bu testler yine üç bakteri ve özgün fajları ve AuNPs kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Farklı deney setleri uygulanmıştır. Bakteriler/fajları temsil eden çok ilginç pikler elde edilmiştir. Özgün fajların zaman kontrollu olarak ilavesi ile (piklerin zamanla değişimi izlenerek) özgün tanı yapılabileceği gösterilmiştir. Bakteriyofajların hem depolamada hem de kullanımda hem aktivitelerini korumalarını hem de etkin kullanımlarını sağlamak için yapılan öncü çalışmalarda jelatin hidrojel mikrokürlere yüklenmeleri sağlanmıştır. Jelatin mikroküreler önce süspansiyonda jelleşme ile küresel formda hazırlanmış sonraki adımda "dehidrotermal" yöntemle çapraz bağlanmıştır. E.coli T4 fajı kuru jelatin mikrokürelere faj çözeltisi emdirilerek yüklenmiştir. Sulu ortamda salım hızları elde edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Özellikle çok kolay hazırlanan çapraz bağlı stabil jelatin mikrokürelere yüklemenin hızlı ve kolay yapılabilmesi önemle not edilmiş ve devam eden sonraki çalışmalarda bu yaklaşımın kullanılmasına karar verilmiştir. Anahtar Kelimeler: Patojenik bakteriler, Tanı, Bakteriyofajlar, Nanopartiküller, SERS, LSPR, MALDI-TOF MS, Gelatin hidrojel mikroküreler, Faj yükleme ve salım.