Investigation of the role of neurotrophin receptor associated death domain protein in regulation of Wnt/β-catenin signaling using the embryonic and CRISPR/Cas9 knockout models of zebrafish

Wnt/ β-katenin sinyal yolu, gelişim ve yetişkinlik döneminde hücre proliferasyonu, göçü, farklılaşması ve apoptoz gibi birçok biyolojik süreçte önemli roller oynar. Yıllar boyunca araştırmacılar tarafından yolun birçok düzenleyici molekülü ortaya çıkarılmasına rağmen tüm mekanizma hala kayıp parçaları olan ve çözülmeyi bekleyen bir yapboz gibidir. Bu çalışmada, bir p75NTR homoloğu olan nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi (nradd) geninin, zebra balığı embriyolarında Wnt /β-kateninkatenin sinyal yolağının negatif bir geri bildirim düzenleyicisi olduğunu belirledik. Zebra balığı embriyolarında nradd'ın aşırı ifade edilmesinin gastrulasyon sırasında Wnt8 aracılı /-katenin sinyal iletimi tarafından kontrol edilen ventrolateral mezoderm hücre kaderlerini ve nöroektodermal hücre kaderlerini önemli ölçüde baskıladığını ortaya çıkardık. Ayrıca, nradd aşırı ifadesi Lymphoid Enhancer Binding Factor 1(Lef1), Sp5 transcription factor-like (Sp5l), and conductin (Axin2) gibi Wnt hedef genlerinin ifadesini bastırıp, aşırı yüksek Wnt8 aracılı /β-katenin sinyal aktivitesi sonucu embriyolarda oluşan, ön beyin ve gözlerin kaybı gibi etkileri kurtarmıştır. Ek olarak, CRISPR/Cas9 gen düzenleme sistemi ile oluşturulan nradd F0 fonksiyon kaybı modelini araştırdık. F0 embriyolarında nradd fonksiyon kaybını verimli bir şekilde gözlemlemek için, tek hücreli embriyolara nradd genini hedefleyen 4 kılavuz RNA içeren Cas9 proteinini enjekte ettik. Yaklaşımımız, F0 crispantlarda nradd ifadesini önemli ölçüde bastırmıştır. Crispantlarda, Wnt-hedef genlerin ifadeleri, önemli ölçüde artması, Wnt /β-katenin sinyallemesinde Nradd'ın negatif düzenleyici rolünü desteklemiştir. Ayrıca, önceki çalışmalarda Nradd'ın tanımlanmış apoptotik işlevini değerlendirmek için crispantlarda apoptoz seviyesi de analiz ettik. İlginç bir şekilde 24 saatlik crispant embriyolarda, pro-apoptotik genlerin artan ekspresyon seviyesi ve bölünmüş kaspaz-3 antikorunun artan immünoreaktivitesi ile teyit edilen artan bir apoptoz seviyesi gözlemledik. Özetle, Nradd'ın Wnt /β-katenin sinyal yolağının negatif bir geri bildirim düzenleyicisi olduğunu ve embriyonik gelişim sırasında hücre ölümünün bir düzenleyicisi olarak hareket ettiğini ortay çıkardık. Yolak düzenleyicileri, özellikle kanser için hedeflenen tedavilerde ilaç hedefleri olarak hizmet ettiğinden, moleküler düzeyde Nradd'ın daha fazla karakterizasyonu, hem henüz bilinmeyen yolak mekanizmalarının aydınlatılmasına hem de yolu hedefleyen yeni ilaçların keşfedilmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.