Organik çöplerden elde edilen besiyerinde üreyen Apergillus niger' den proteaz enzimi üretimi ve karakterizasyonu

Endüstriyel enzimler ile ilgili çalışmalar teknolojinin gelişmesi, kullanılan ürünlerin kullanım alanlarının artması ve ekonomik değerinin yüksek olması gibi sebeplerden kaynaklı önemlidir. Günümüz dünyasında, nüfus her geçen gün artmaktadır ve bu nedenle artan atık oluşumu gerçeğini düşünmek elzemdir çünkü oluşan atık gereksinimleri karşılanabilirse, üretim maliyetinde önemli ölçüde azalma sağlanabilmektedir. Bu nedenle çalışmamızda proteazın kolay, hızlı ve düşük maliyetli şekilde üretimi için elzem parametreler optimize edilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında; optimum proteaz enzimi üretmek için meyve ve sebze atığı, karbonhidrat bazlı ve protein (hayvansal veya bitkisel) oranı yüksek organik atıklarından besiyerleri hazırlanarak enzimin bu besiyerlerinde üreme potansiyelleri farklı pH (5,0, 5,5, 6,0) ve farklı inkübasyon sürelerinde (24, 48, 72 saat) Taguchi yöntemi ile araştırıldı. Taguchi yöntemiyle hesaplanan en yüksek sinyal/gürültü (S/N) oranına sahip olan seviyeler dikkate alındığında, proteaz enzim üretimi için 30 °C'de 24 saat inkübasyon süresi, pH 5,5 değeri, ve %50: 50 bitkisel ve hayvansal protein oranına sahip besiyeri şartlarının optimum şartlar olduğu belirlenmiştir. Aktiviteyi en fazla etkileyen faktörün protein oranı olduğu ve daha sonra sırasıyla inkübasyon süresi ve pH değerinin aktiviteyi etkilediği belirlendi. İnkübasyon süresinin uzaması, pH değeri ve hayvansal protein oranının artması, aktivite değerinde azalmaya sebep olduğu görüldü. A. niger' den üretilen proteaz enzimi TPP (üçlü faz ayırma) yöntemi ile saflaştırılmış ve biyokimyasal karakterizasyonları incelenmiştir. Bu yöntem geniş bir uygulama alanına sahip, çok yönlü bir biyoayırma aracı haline gelen, yüksek geri kazanım ve saflık seviyelerine sahip bir dizi enzim ve proteini saflaştırmak için kullanılır. TPP sistemi ile proteaz enzimi 1,0:1,5 (ham enzim çözeltisi: t-bütanol oranı) ve %80 doygun amonyum sülfat konsantrasyonu ile %235,7 verimle 13,15 kat saflaştırıldı. Enzimin alt fazda toplandığı tespit edildi ve karakterizasyon çalışmaları için alt faz kulanıldı. A. niger' den saflaştırılan proteaz enziminin optimum ve stabil pH'ları sırasıyla 10,0 ve 9,0; optimum ve stabil sıcaklığı ise 60°C olarak tespit edildi. Proteaz enziminin okside edici ajanlar ve yüzey aktif maddeleri varlığında gösterdiği aktivite değerleri incelendiğinde SDS' in ciddi bir aktivite kaybına sebep olduğu, diğer maddelere nazaran %1'lik H_2 O_2 varlığında aktivitesini koruduğu tespit edildi. Tween 20, Tween 80 ve TrionX-100 varlığında yakın sonuçlar göstererek belli oranlarda azalmaya sebep oldu. Serin proteaz inhibitörü fenilmetilsülfonilflorid (PMSF) varlığı aktiviteyi sıfıra yakın bir değerde inhibe ederken, β-merkaptoetanol aktivitede artışına sebep oldu. Metaloenzim inhibitörü olan Etilen Diamin Tetra Asetik Asitin (EDTA) özellikle %5 konsantrasyonunda aktiviteyi azaltması enzimin metal bağlama bölgesine sahip olduğunu göstermiştir. Enzimin substratlarla olan ilişkisi incelendiğinde kazein ve azokazeinin aktivitede değişiminde olumlu etkileri olurken, hemoglobin, jelatin ve BSA' nın aktivitede azalmaya sebep olduğu görülmüştür.