Identification of important residues for modulation of allosteric properties of potato ADP glucose pyrophosphorylase

ADP-glikoz pirofosforilaz (AGPaz), allosterik enzim olma özelliğiyle karbon akışını kontrol eden, bakterilerde glikojen; bitkilerde nişasta sentezinde görev alan anahtar bir düzenleyici enzimdir. Bakteri AGPaz'ı tek alt birimden oluşmasına rağmen, bitki AGPaz'ı farklı görevli alt birimler içerip heterotetramer (?2ß2) yapıdadır. Büyük alt birim (LS), katalitik olan küçük alt birimle (SS) etkileşerek allosterik düzenlemede görev alır. LS, SS'in katalitik aktivitesini, heterotetramerik enzimin allosterik regülatör cevabını artırarak düzenler. Bitki hücresinde AGPaz'ın kararsız halde bulunduğu bilinmektedir. Önceki çalışmalarda patates AGPaz'ının heterotetramerik modelinde küçük alt birimle etkileşen büyük alt biriminin önemli aminoasitleri hem deneysel hem de hesaplamalı olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada amaç ters genetik yaklaşımı ile, patates AGPaz enziminin heterotetramer oluşumunu artırmak ve alt birimlerin birbirleriyle olan etkileşiminin enzimin allosterik düzenlenmesini etkileyip etkilemediğini araştırmaktır. Bu nedenle heterotetramerik enzim oluşturamayan LSR88A mutantı rastgele mutasyona tabi tutulmuş ve SS içeren glgC- E.coli hücresinde (AGPaz akitivitesi olmayan) glikojen üretimini geri kazananların iyot buharı ile boyama yöntemiyle seçilmesi amaçlanmıştır. 15 baskılayıcı mutant seçilmiş ve mutantların sekans analizi mutasyonların bir kısmının alt birim ara yüzünde meydana geldiğini göstermiştir. Bir sonraki aşamada, seçilen mutantlarda R88A mutasyonunun varlığında veya yokluğunda heterotetramer oluşumunun artıp artmadığına bakmak için R88A mutasyonu, bölgeye yönlendirilmiş mutajenez ile geri çevrildi. RM2 ve RM10 mutantlarının kinetik karakterizasyonu bu mutantların yabanıl tip enzime göre farklı allosterik özelliklere sahip olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar büyük alt birim ve küçük alt birim arasındaki ara yüzün AGPaz enziminin allosterik özellikleri için önemli olduğunu göstermektedir. Daha karalı ve daha iyi regüle olan AGPaz varyantlarını elde etmek, bu mutantların bitkilerdeki nişasta miktarını artırmak için kullanılmasını sağlayacaktır.