Phosphoproteomic analysis of class ia P110b isoform-specific signal transducers upon pi3k pathway activation

PI3K sinyal yolağı etkinleşmesi çeşitli kanserlerde yaygın görülen bir olaydır. Hücre büyümesi, göçü ve metabolizmasını düzenlemesi nedeniyle bu sinyal yolağı kanser terapisi ve ilaç direncinin kırılması üzerine yapılan çalışmalarda sıkça hedef alınmıştır. PI3K Sınıf IA izoformlarına odaklanan çalışmalar belirli molekülleri hedef alan farklı tedavi yöntemlerinin uygulanabilmesi için önemli bir hale gelmiştir. Hali hazırdaki bulgular Sınıf IA izoformlarının etkinleşme hatlarının farklı olduğunu gösterirken izoformlara özgü aşağı yöndeki hedef moleküller daha önce tümüyle tanımlanmamıştır. Bu çalışma PI3K sinyal yolağının etkinleşmesi sonrasında p110B izoformuna özgü aşağı yöndeki moleküllerin fosfoproteomik analizine odaklanmaktadır. Bu amaçla öncelikle p110B izoformunu kodlayan PIK3CB genini ya da bu genin katalitik (E1051K) ve helikal bölge (N553S) mutantlarını fare embryonik fibroblast hücrelerinde ifade eden doksisiklin indüksiyon sistemi yarattık. Immunoblotting deneyleri ile aşağı yöndeki fosforilasyon olayları MEF p110B mutant hücreler ya da PI3K etkinleştirmesi sonucu MEF p110B yabanıl tip hücreler için analiz edilmiştir. Sonuçlarımız Sıvı Kromatografi- Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) ile elde edilen karşılaştırmalı fosfoproteomik veri ile desteklenmiştir. Bulgularımızın gösterdiği üzere PI3K sinyal yolağının kısa süreli etkinleştirilmesi sonucu transkripsiyon ve hücre iskeleti düzenlemesi, hücre içi sinyal iletimi, hücre göçü ve metabolizması ile ilgili proteinler açlık durumundaki hücrelere göre ayrımsal bir şekilde fosforile edilmektedir. Bunun yanı sıra, uzun süreli uyarılma sonucu hücre döngüsünün ilerlemesi, fosfataz etkinliği, nükleositoplazmik taşıma ve RNA metabolizması ile eşleştirilen geç cevap proteinlerine karşılaştırmalı fosfoproteom içerisinde sıkça rastlanmıştır. Yabanıl tip B hücrelerinde kısa süreli etkinleşme sonucu rastlanan proteinlere benzer şekilde B E1051K mutant hücrelerinin fosfoproteomu da hücre iskeleti düzenlemesi ve hücre göçü ile alakalı proteinler ile eşleştirilmiştir. Bu hücrelerde gözlemlenen morfolojik değişimlere paralel olarak hücre anatomisinin düzenlenmesinde görev alan proteinler de bulunmuştur. Ayrıca, bazı tümör baskılayıcı ve onkogen proteinleri de ayrımsal olarak fosforile edilen proteinler arasında yer almıştır. Öte yandan, B N553S hücrelerine ait fosfoproteomun yabanıl tip B hücrelerinde uzun sürede etkinleşme sonucu elde edilen proteinlere benzer şekilde RNA metabolizması, nükleer import ve apoptozun düzenlenmesi görevleri açısından zengin olduğu gözlemlenmiştir. Yapısal düzenleme ve mikrotübül montajında görev alan proteinlere de rastlanmıştır. 37 kDa boyutundaki Akt substratı Poly(rC) Binding Protein 1 (Pcbp1), mutantların ve yabanıl tip p110B'yı ifade eden hücrelerin fosfoproteomu arasında ayrımsal şekilde fosforile edilen ortak bir protein olarak bulunmuştur. RNA'ya bağlanma özelliği olan bu protein metastaz ve epithel-mezenkimal geçiş (EMT) ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca RNA kararlılığı ve işlenmesini yönetmesi nedeniyle gen ifadesi üzerinde önemli bir göreve sahiptir. Bu çalışmanın sonucunda elde ettiğimiz sonuçlara göre p110B izoformunun hücre iskeletinin ve transkripsiyonun düzenlenmesi ile hücre göçü üzerinde kayda değer bir etkisinin olması p110B-Pcbp1 ekseninin düzenlenmesinin p110B bağımlı hücrelerdeki tümör ilerlemesinin mekanizmalarını anlamamız konusunda öncü bir görev oynayabileceğini ortaya koymaktadır.