Effects of metabolic engineering of ethanol utilization pathway in Pichia pastoris on recombinant protein production and transcription levels in central metabolism

Bu yüksek lisans tezinde, etanol tüketim hızının artırılması ve etanol yolizi üzerindeki yan-ürünlerin üretiminin azaltılması ile iyi işleyen hücre içi reaksiyon ağının elde edilmesi hedeflenmiştir. Metabolik mühendislik ile etanol yolizi üzerindeki hız kısıtlayıcı reaksiyonları katalizleyen iki enzimin, alkol dehidrogenaz (ADH2) ve Asetil Koenzim A sentaz (ACS1), ayrı ayrı ve beraber aşırı ekspresyonu ile özgün konak Pichia pastoris geliştirilmiştir. Metabolik mühendislik ile geliştirilen yeni Pichia pastoris ekspresyon sistemlerinin; i) ADH2-OE, ii) ACS1-OE, iii) ADH2-OE ve ACS1-OE hücre çoğalması, etanol tüketim hızı ve yan-ürün oluşumuna etkileri araştırılmıştır. ADH2 aşırı ekspresyonunun, PADH2-wt:: ADH2 kaseti ile oluşturulan P. pastoris suşlarının hücre çoğalması üzerine etkisi, üç ADH2 gen kopyası ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan kolonileri ile %2 (h/h) başlangıç etanol derişiminde araştırılmıştır. Doğal P. pastoris X-33 ile karşılaştırıldığında, üç ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan hücreler ile sırasıyla 1.11 kat ve 1.35 kat daha düşük hücre derişimi elde edilmiştir. Fermentasyonun t = 36 st'te, P. pastoris X-33 ile üretimle kıyaslandığında, üç ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan hücreler ile yan-ürün asetik asit derişimleri sırasıyla 1.46 kat ve 3.97 kat, yan-ürün asetaldehit derişimleri de sırasıyla 1.18 kat ve 2.28 kat artmıştır. ADH ve ACS1 aşırı ekspresyonlarının, i)ADH2-OE, ii) ACS1-OE ve iii) ADH2-OE ve ACS1-OE ile oluşturulan P. pastoris suşlarının çoğalması üzerindeki etkisi, %1 (h/h) başlangıç etanol derişiminde araştırılmıştır. Fermentasyon sonunda ADH2-OE ve ADH2-OE+ACS1-OE'ye göre ACS1-OE ile 1.08 kat ve 1.12 kat daha yüksek hücre derişimleri elde edilmiştir. Ayrıca, P. pastoris X-33 ve ADH2-OE'ye kıyasla fermentasyonun t = 36 st'te ACS1-OE için hücre dışına aktarılan asetik asit derişimlerinde 1.49 kat ve 1.78 kat azalma olmuştur. ADH2-OE + ACS1-OE suşları için t = 9 st'te spesifik etanol tüketim hızı (qEtOH) sırasıyla 0.52 and 0.35 g g-1 h-1 olarak bulunmuştur; P. pastoris X-33 (qEtOH = 0.19 gg-1h-1) ile karşılaştırıldığında, ADH2 aşırı ekspresyonunu etanol tüketim hızını artırmıştır. ADH2 ve ACS1'in aşırı ekspresyonunun merkezi karbon metabolizmasının transkripsiyon seviyeleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Etanol tüketim yolizi üzerinde yer alan üç enzimi kodlayan genler, ADH2, ALD4 ve ACS1, metabolik mühendislikle tasarlanmış üç ekspresyon sistemininde de upregüle olmuştur. ACS1 aşırı ekspresyonunun r-protein üretimi üzerindeki etkisini araştırmak için, raportör r-protein mApple geninin PADH2-Cat8-L2'nin kontrol altında ekspres edildiği ve ACS1'in PAOX1/Cat8-L3 altında aşırı ekspres edildiği yeni bir ekspresyon sistemi geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yeni konak hücre, ACS1-OE-C4+mApple-C1 ile %1 (h/h) başlangıç etanol derişiminde üretimde t= 24 st'te mApple üretiminin 1.2-kat, t=45 st'te ise 1.32-kat arttığı bulunmuştur.