PLAGL2'nin CRISPR/Cas9 yöntemiyle susturulduğu hacat keratinosit hücre hattının karakterizasyonu

Dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi gören çok katmanlı epidermisin ana hücresi keratinositlerdir. Epidermisin oluşumu ve yenilenmesi p63 transkripsiyon faktörü tarafından koordine edilen keratinosit farklılaşmasıyla gerçekleşir. Keratinosit farklılaşmasında önemli bir rolü olan RIPK4'ün işleyiş mekanizmasına yönelik çalışmalarımızda, insan keratinosit cDNA kütüphanesi RIPK4'ün yem olarak kullanıldığı büyük ölçek maya-ikili hibrit yöntemiyle taranmış ve RIPK4'ün, bir transkripsiyon faktörü olan PLAGL2 ile etkileştiği bulunmuştur. Bu etkileşim hem küçük ölçek maya-ikili hibritle tekrar mayada hem de farklı protein-protein etkileşim yöntemleriyle insan hücre hatlarında doğrulanmıştır. PLAGL2'nin RIPK4 ile etkileşimi ve RIPK4'e benzer şekilde, ekspresyonunun p63 tarafından düzenlenmesi, RIPK4 gibi PLAGL2'nin de keratinositlerde bir rolü olduğu hipotezini ortaya çıkarmıştır. Bugüne değin yapılan çalışmalar daha ziyade PLAGL2'nin karsinogezdeki rolünü tanımlamaya yönelik olmuştur. Literatürde PLAGL2'nin keratinositlerdeki rolünü gösteren bir çalışma bulunmamaktadır. Bu bağlamda tez çalışmamızla amaçlanan PLAGL2'nin keratinositlerdeki temel hücresel fonksiyonlar üzerinde bir rolü olup olmadığını araştırmaktır. Bu amaca yönelik ilk aşamada PLAGL2'nin ekspresyonu, HaCaT keratinosit hücre hattında CRISPR/Cas9n sistemiyle susturuldu. Sonrasında, oluşturulan PLAGL2 knock-out hücreler morfoloji, büyüme hızı, hücre döngüsü, hücre hareketi ve hücre ölümü gibi temel hücresel fonksiyonlar açısından incelendi. Ayrıca bu hücrelerde, PLAGL2 tarafından düzenlendiği farklı hücrelerde gösterilmiş olan Wnt/β-katenin sinyal yolağı iletimi de araştırıldı. Sonuç olarak, PLAGL2'nin susturulması keratinositlerde hücre döngüsü üzerinde herhangi bir değişime neden olmazken, hücre ölümü ve hareketinde belirgin bir artışa neden olduğu görüldü. Hücreler morfolojik olarak incelendiğinde hücre büyüklüğünün ve hücre hareketiyle ilişkili filopod yapılarının arttığı görüldü. Bunlara ilaveten, Wnt/β-katenin sinyal yolağı etkinliği PLAGL2 knock-out hücrelerde kontrole kıyasla azalma gösterdi. Sonuçlarımız, PLAGL2'nin deri gelişiminde bir rolünün olabileceğine dair ipuçları vermektedir.