Engineering of probiotic Saccharomyces boulardii as a host for living therapeutic applications

Hastalıkların tedavisinde kullanılan terapötik moleküller veya biyolojik olarak aktif maddeler, yüksek maliyetli ve sınırlı erişilebilirlik ile kimyasal sentez yöntemleri kullanılarak üretilmektedirler. Terapötik moleküller üretmeye yönelik bu yaklaşım, yaşamı değiştiren maddelerin üretilmesini sağlasa da, hala tedavi bekleyen sayısız hastalık vardır. Bu nedenle çok sayıdaki bu hastalıkların tedavi ihtiyaçlarını sadece konvansiyonel üretim yaklaşımları ile karşılamak mümkün olmayacaktır. Canlı terapötikler, terapötik moleküllerin üretimi ve insan vücuduna doğrudan verilmesi için programlanmış hücrelerdir ve endüstriyel ortamlarda biyomoleküller üretmek için uzun süredir kullanılmaktadırlar. Ayrıca, kanser, diyabet, inflamatuar bağırsak sendromu, ülser ve kolit gibi hastalıkları tedavi etmek için canlı organizmaları tasarlayan ve programlayan birçok çalışma yapılmıştır. Saccharomyces boulardii CNCM I-745, insanlarda çok uzun süredir probiyotik olarak kullanılan bir maya suşudur. S. boulardii, bugüne kadar insan tıbbında kullanılması onaylanan ilk ve tek maya suşudur. S.boulardii'nin mikrobiyomu yenilemek ve patojenlerle rekabet etmek de dahil olmak üzere konakçısına birçok faydası olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, S.boulardii, insan vücudu ile büyük uyumluluğu ve karmaşık moleküller üretmemizi sağlayan metabolik özellikleri nedeniyle canlı bir terapötik fabrika olarak tasarlanıp programlanacak umut verici bir organizmadır. Bunu hedefleyerek, antibiyotik direncinin yayılması için sorun yaratacağından ileriki adımlarda antibiyotik direnç genlerinin kullanımını ortadan kaldırmak için sentetik biyoloji araçlarını kullanarak bir TRP1 auxotroph S.boulardii suşu oluşturduk. Bunu yapmak için, CRISPR CAS-9 sistemini ve hedef gene (TRP1) eklenecek bir durdurma kodonunu barındıran bir donör DNA'yı kullandık. TRP1 oksotrof suşunun yapısını doğruladıktan sonra, güçlü, kurucu bir promotör, hücre dışı sinyal dizisi (Alfa dizisi) ve bir sonlandırıcı (CYC1) içeren bir epizomal ekspresyon vektörü tasarladık. Daha sonra, rekombinant olarak üretmek ve bağırsağa salgılamak için Intrinsic Factor proteini (B12 vitamini emiliminden sorumlu anahtar protein) dizisini vektöre yerleştirdik. Ancak, ön verilerimize göre, ilgilenilen proteinin bir ifadesini gözlemleyemedik, bu da sistemin düzgün çalışması için daha fazla optimizasyon ve araştırmaya ihtiyaç duyduğunu gösteriyor. Terapötik amaçlar için tasarlanabilecek oksotrofik maya suşlarının eksikliği göz önüne alındığında, mühendislik ürünü S.boulardii suşumuz, tedavisini bekleyen farklı bozukluklara karşı maya bazlı canlı terapötik uygulamalarda kullanılabilir.