The role of Protein Kinase R in lipotoxicity

Protein ve yağ biosentezi, protein katlanması, kalsiyum salgılanması ve dengelenmesini de içeren sayısız fonksiyonuyla Endoplazmik Retikulum (ER) hücresel homeostaz için merkezi bir organeldir. Protein katlanması ya da salgılanmasıyla ilgili bir bozukluk olduğunda, ER zarlarından katlanmamış protein yanıtı (KPY) adı verilen özgün bir sinyal cevabı başlatır. KPY düzgün katlanmamış protein seviyesini azaltarak ER homeostazını eski haline getirmek için girişimde bulunur, fakat eğer ER homeostazı tekrar elde edilemezse ya da ER stresi uzun süreliyse KPY apoptoza yol açabilir. Üç özel ER zar proteini, inositol-gerektiren enzim-1 (IRE1), Protein Kinaz R?yi (PKR) anımsatan kinaz (PERK) ve aktifleştiren transkripsiyon faktör 6 bu yolakta stres sensörü olarak rol alır ve ER homeostazını tekrar sağlamak için ayrı fakat birbirinin içine geçmiş sinyal yolaklarını başlatır. Yakın zamanda, çalışmalar gösterdi ki aşırı beslenme, özellikle dolaşımda olan yüksek miktarda doymuş yağ asitleri ya da kolesterol, metabolik dokularda ER stresini indükler ve bu indüksiyon KPY sinyal yolaklarının aktifleşmesine yol açar. Ayrıca ER stresinin obezite, insülin direnci, tip 2 diyabet, ve aterosklerozis gibi metabolik hastalıklarının patogenezinde sebepsel bir rol oynadığı gösterilmiştir. Interferon ile indüklenebilen ve çift sarmallı RNA ile aktifleşen protein kinaz R?nin (PKR) de ER stresi sırasında aktifleştiği bilinmektedir.Son çalışmalar ayrıca PKR?nin ER stresi boyunca lipidler ile ve obez farenin metabolik dokularında aktifleşebileceğini göstermiştir. PKR?nin genetik ablasyon ya da inhibe edilmesi kemirgen modellerdeki obezitede insülin duyarlılığını ve sistemik glukoz homeostazını arttırır. Fakat PKR?nin aşırı beslenme ile ya da ER stresiyle nasıl aktifleştiği bilinmemektedir. Aslında yağ ile indüklenmiş hücresel streste ya da ölümdeki, birçok özel hücresel bileşen ve moleküler mekanizma, yani lipotoksisite tam olarak anlaşılamamıştır. PKR yağ ile indüklenen ER stresinde aktifleştiği bilinen serin/treonin kinazlarından biridir, fakat sadece birkaç özel substratı bilinmektedir ve bunlar PKR?nin kronik metabolik hastalık patogenezindeki lipotoksisitede PKR?nin rolünü açıklamada yetersiz kalmaktadır. PKR ayrıca inflamazom bileşenleriyle etkileşime girerek, inflamazom aktivasyonunda önemli bir rol alır. PKR?nin kronik metabolik hastalıklarda besin ile indüklenen iltihaplanma ve metabolizmadaki özel moleküler eylemlerine ilişkin bilgimizde bir boşluk bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında, benim ana amacım PKR?nin aktivitesini düzenlemek için özel araçlar geliştirmek ve onun lipotoksisitedeki özel substratlarını ve yağ ile indüklenen ER stresi cevabında oynadığı rolü araştırmaktı. Bu amaçla, PKR?nin ER stresi sırasındaki kinaz aktivitesini özel olarak mofidiye etmek için özgün bir kimyasal-genetik yaklaşımı geliştirdim. Bu yaklaşımda, ATP analoglarının (engelleyen ya da aktifleştiren) PKR?nin ATP bağlanma boşluğuna uyum sağlayabilmesi için PKR?nin ATP bağlanma boşluğundaki iri hacimli yan-zincir bekçi aminoasit (metiyonin gibi) daha küçük yan-zincir aminoasitine (glisin gibi) değiştirilir. PKR?nin bu mutantı ATP analoğuna duyarlı kinaz (AZKA) olarak adlandırılır ve bu mutantın kinaz reaksiyonlarında normal ATP?nin yanında iri hacimli ATP analoglarından da yararlandığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, ben PKR kinazının inhibe eden iri hacimli-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (NaPP1) or 4-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (1-NMPP1) gibi ATP analoglarıyla inhibe oluşunu gösterdim. Potansiyel PKR substratlarını tanımlamaya bir adım daha yaklaşmak için, ayrıca immünoçökeltilmiş PKR AZKA mutantı için kinaz reaksiyonlarını optimize ettim ve başlangıçtaki deneylerimde potansiyel aşağı sinyal yolaklarındaki substratlarını görüntüledim. Son olarak, yağ ile indüklenen ER stresi koşullarında, iki ER stresi ile ilgili kinasın arasındaki özgün ilişkiyi çalıştım. IRE1 kinazının kinaz değil ama endoribonükleaz aktivitesini bir inhibitör ile inhibe ettiğimde, yağlara bağlı PKR aktivasyonunun tamamen kaybolduğunu gözlemledim. Bu bulgular IRE1 kinazının RNAse aktivitesinin PKR kinazının yağ ile aktifleşmesi için gerekli olduğu bilgisini güçlü bir şekilde destekler. IRE1 kinazının RNAse bölgesinin bu fonksiyonu özgündür ve umulmadıktır. Bu araştırmanın gelecekteki hedefi IRE1-PKR bağlantısındaki RNA aracılarını keşfetmeye ve bu bunların kronik metabolik hastalıklarla ilşkili inflamatuar ve metabolik patolojilerdeki rolünü araştırmaya yönlendirilmelidir. Sonuç olarak, tez çalışmamda, PKR?nin kinaz aktivitesini özel olarak modifiye etmek ve bu şekilde özgün PKR substratlarını keşfetmek için özgün bir kimyasal-genetik yaklaşım geliştirdim. Bu tezde bulunan ön bulgulara göre, yağ ile indüklenen ER stresi esnasında PKR?nin birçok tanımlanmamış substratı var gibi görünmektedir. Buna ek olarak, kimyasal-genetik PKR?yi kimyasal genetik aracı olarak kullanarak ve başka diğer yaklaşımlarla, lipotoksisite esnasında IRE1 ve PKR kinazları arasında benzersiz, fonksiyonel bir ilişkinin varlığını gösterdim. Ayrıca, tezimdeki sonuçlar göstermekte ki; IRE1 kinazının endoribonükleaz aktivitesi PKR kinazının yağlar tarafından aktifleştirilmesi için gerekli ve yeterlidir. Çalışmalarım esnasında geliştirilen bu bulgular ve araçlarında, metabolik hastalıkların sağlıksal sonuçları için önemli olan PKR?nin lipotoksisitedeki özel rolünün analizi için daha fazla yararlanılabilir. Anahtar kelimeler: KPY, ER stresi, PKR, IRE1, Yağlar