Pseudomonas aeruginosa izolatlarının antibiyotiklere direnç mekanizmalarında aktif atım pompaları ve porin proteinlerinin etkisinin araştırılması

Bu çalışmada çoğul ilaç dirençli, izole karbapenem ve izole kinolon dirençli Pseudomonas aeruginosa izolatlarının antibiyotik duyarlılık paternlerinin değerlendirilmesi ve antibiyotik direncinde aktif atım pompalarının ve porin proteinlerinin etkisinin araştırılması amaçlandı. Laboratuvarımıza Kasım 2010 ve Kasım 2011 tarihleri arasında rutin olarak gönderilen tüm klinik örneklerden izole edilen izolatlar tür düzeyinde tanımlandı. Çalışmaya dahil edilen 50 klinik P. aeruginosa izolatının antibiyotik duyarlılık testleri Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle yapılarak CLSI önerileri doğrultusunda değerlendirildi. Otomatize Vitek 2 sistemiyle (bioMerieux, Fransa) seftazidim, gentamisin, piperasilin, siprofloksasin, imipenem ve meropenemin minimal inhibitör konsantrasyonları (MİK) belirlendi. mexB, mexD, mexF, mexY, ampC, oprD bölgelerinin transkripsiyon ürün seviyeleri gerçek zamanlı polimerize zincir reaksiyonu (qPCR) yöntemiyle belirlendi. Birbiriyle bağlantılı suşlar arasındaki benzerliği değerlendirebilmek için arbitrarily primed PCR (AP-PCR) kullanıldı.Çalışmamızda dört farklı gruba ayırarak incelediğimiz 50 izolat arasında oprD down regulasyonunu, atım pompa ve ampC aşırı ekspresyonlarını gösteren genlerin görülme sıklığı sırasıyla mexD (%88), mexB (%76), mexF (%46), ampC (%46), mexY (%40), oprD (%38) olarak belirlendi. İzolatlar arasındaki benzerliği gösterebilmek için kullandığımız AP-PCR yöntemiyle de 18 farklı patern tespit edildi.Çalışmamızdaki imipenem dirençli 38 izolatın 32'sinde (%84) mexD, 26'sında (%68) mexB, 23'ünde (%61) ampC, 19'unda (%50) mexY, 15'inde (%39) mexF aşırı ekspresyonu görüldü. oprD mRNA düzeyleri, imipenem dirençli 38 izolatın 20'sinde düşük bulundu. Dokuz izolatta ise oprD miktarı tespit edilemedi. İzole karbapenem dirençli grupta oprD mRNA düzeylerinde anlamlı azalma görülen 4 izolattan birinde sadece oprD down regulasyonu görülürken diğer 3 izolatta eş zamanlı olarak mexB aşırı ekspresyonu, birinde mexD aşırı ekspresyonu ve ikisinde ampC aşırı ekspresyonu tespit edildi.Çalışmamızdaki meropenem dirençli 35 (%70) izolat arasında MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN ve MexXY-OprM atım sistemlerinin aşırı ekspresyonu sırasıyla 25 (%71), 28 (%80), 16 (%46) ve 19 (%54) bulundu. Meropenem dirençli bu izolatlarımızın 33'ünde (% 94) atım sistemlerinden en az birinin tespit edilmesi ise meropenem direncinde bu mekanizmaların katkısını göstermektedir. Meropenem dirençli 35 (%70) izolat arasında mexB aşırı ekpresyonu olmayan 6 izolatın 5'inde oprD ekspresyonu anlamlı şekilde düşük tespit edildi.Meropeneme direnç gelişiminde OprD kaybı ve MexAB-OprM pompasının upregulasyonu rol oynadığından meropeneme direnç gelişimi imipeneme direnç gelişiminden daha zordur. Çalışmamızdaki imipenem dirençli 38 izolatın 30'u meropenem dirençli bulunmuştur. İzole karbapenem dirençli 9 izolattan 7'sinde oprD miktarındaki azalma ile imipenem ve meropenem MİK'lerinde görülen eş zamanlı artış, oprD'nin karbapenem direncindeki etkisini kuvvetle desteklese de direnç genlerinin aşırı ekspresyonlarının da eş zamanlı olarak görülebilmesi direnç gelişimindeki sinerjistik etkiyi düşündürmektedir.İzole kinolon dirençli gruptaki 12 izolatta oprD miktarı 6 izolatta düşük bulundu. Bu gruptaki mexF ekspresyonunun biri hariç diğer tüm izolatlarda yüksek bulunması, imipeneme duyarlı olan bu izolatlarda mexF aşırı ekspresyonu ile oprD down regulasyonunun ilişkili olabileceğini ve imipeneme direnç gelişimindeki etkisinin ilave çalışmalarla desteklenmesi gerekliliğini göstermektedir.AmpC aşırı ekspresyonu görülen suşların 21'i (%91) antipseudomonal ß-laktamlara ve aminoglikozidlere dirençli izolatların bulunduğu birinci grupta görüldü. Üçüncü ve dördüncü gruptaki kinolon dirençli izolatlarda aşırı ekspresyon görülmemesi ise AmpC'nin kinolon direncinde etkisi olmadığını düşündürmektedir.Çalışmamızda incelediğimiz direnç genlerinin P. aeruginosa direnç mekanizmalarındaki yeri büyüktür. Bu mikroorganizmayla meydana gelen enfeksiyonların tedavisinde izlenen protokolüne tanımlanan bu mekanizmalar yol göstermektedir. Antimikrobiyal dirençle mücadelede yeni stratejilerin geliştirilmesinde öncelikle yapılması gereken bu direnç mekanizmalarının ekspresyonunun hangi mekanizmalarla düzenlendiğinin açıklanması olmalıdır.