Molecular cloning and production of recombinant hODF extracellular domain

İnsan osteoklast değişim faktörü (hODF), osteoblastlar tarafından üretilen membrane proteinidir. Proteolitik olarak kesilmesiyle 143-317 amino asitlerden oluşan kesik-ekstraselüler domainini açığa çıkarır. hODF ekstraselüler domaini osteoclast membranındaki reseptörü olan RANK'e bağlanır ve aktive eder. Aktive edilmiş RANK, NF-KB'nin aktivasyonuna ve hücre çekirdeğine lokalize olmasına sebep olan hücre içi sinyal yolağını tetikler ve osteoklastogenik genlerin transkripsiyonuna sebep olur. Bu nihayetinde osteoklastların farklılaşmasını ve aktivasyonu ile sonuçlanır ki bu da kemikleri yeniden biçimleme yanıtıdır. Osteoklast oluşumunu in vivo ve in vitro olarak çalışabilmek için yeteri miktarda hODF proteinine ihtiyaç duyulur ki ilerki basamaklarda RAW264.7 osteoklast oluşum deneyinde ve in vitro bağlanma testlerinde kullanılabilsin. Bu yüzden biz rekombinant hODF ekstraselüler domainini ekspresyonuna ve saflaştırılmasına karar verdik. Rekombinant hODF, insan hücresinden elde edilen genomic DNAdan oluşturuldu ve moleküler klonlama yöntemleriyle birkaç ekspresyon vektörlerine klonlandı. Farklı saflaştırma statejilerinin denenmesi ve optimize edilmesinden sonra, GST tag edilmiş hODF bakterilerin içinde ekspres edilip glutatyon-agaroz boncuklarıyle saflaştırıldı. hODF, HRV3C proteazı ile boncuklardan ayırıldı ve sonuçlar SDS-PAGE ile analiz edildi. Geliştirdiğimiz protokol ile yaklaşık milligram miktarlarında ve %70 saflıktan daha fazla düzeyde hODF üretildi.