The effects of replacement of five highly conservedaminoacids of subunit-i in cbb3-type oxidase ofrhodobacter capsulatus

Demir-bakır oksidazlar, oksijeni suya indirgeyen, hücre zarına gömülü vezar boyunca proton pompalayan solunum zincirinin son elemanlarıdır. Farklıtürdeki Demir-bakır oksidazların I. alt ünitelerine ait amino asit dizilerieslestirildiginde, R. capsulatus ta bulunan cbb3 oksidaz'a ait serine 333 (S333),serine 340 (S340), threonine 350 (T350), asparagine 390 (N390) ve threonine 396(T396) amino asitlerinin, korunmus oldugu görülmüstür. Bu çalısmada, R.capsulatus'a ait cbb3 tipi oksidazda korunmus olan bu amino asitlerin, enzimininyapı ve islevine etkileri arastırılmıstır.Bu amaçla, cbb3 oksidazın ccoNOQP yapısal genini tasıyan rekombinantpOX15 DNA'sının 2.8 kbp'lik parçası pBluescript vektörüne klonlanmıs ve eldeedilen pMOZI klonu kullanılarak hedeflenen amino asitler yönlendirilmis in vitromutagenez ile alanine dönüstürülmüstür. Mutasyonlar DNA dizi analizi iledogrulandıktan sonra, korunmus amino asitler den birisini tasıyan her bir plazmid,R. capsulatus'un GK32 susuna aktarılmıstır. Elde edilen mutantların enzimaktivitesine etkileri NADI boyama ile gözlemlenirken, mutasyonların enzimüzerindeki yapısal etkileri kromatofor zar proteinlerinin Schägger-tipipolyakrilamid jel de ayrıstırılması ve jelin 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMBZ) ileboyanmıs ile tespit edilmistir.Serin ve tironin mutantları (S340A, T350A ve T396A) yaban tip ile aynıaktiviteye sahipken, serin 333 mutasyonu (S333A) enzim aktivitesini azaltmıs,asparajin mutasyonu (N390A) ise enzim aktivitesini tamamen yok etmistir.Mutantların hücre zarı proteinlerindeki sitokrom c profilleri incelendiginde, S333A,S340A, T350A ve T396A mutantları yaban tip ile aynı profilleri vermis, ancakN390A mutantında sitokrom cbb3 oksidazın cp alt ünitesine rastlanmamıs ve co altünitesinin de azaldıgı görülmüstür. Arastırma sonuçları, serine 333 ve asparagine390 amino asitlerinin R. capsulatustaki cbb3 tipi sitokrom oksidazın aktivitesi yadayapısı üzerinde kritik öneme sahip oldugunu göstermistir.Anahtar kelimeler: Rhodobacter capsulatus, solunum, cbb3 tipi sitokrom coksidaz aktivitesi, yönlendirilmis mutagenez, kromatofor zar proteini izolasyonu,