Saccharomyces cerevisiae DNA barkodunun belirlenmesi ve veri tabanının oluşturulması

Bu tez çalışması kapsamında canlıların tanımlanmasında kullanılan DNA barkodlama teknolojisinden faydalanılarak birçok geleneksel ürün üretiminde, biyoteknolojik proseslerde ve birçok araştırmada kullanılan model bir mikroorganizma olan S. cerevisiae türünün izolasyonu, tanımlanması ve DNA barkodlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında; İç Anadolu Bölgesi'nin farklı şehirlerindeki üzüm bağlarından toprak ve üzüm örnekleri toplanarak maya izolasyonları yapılmıştır. Ayrıca ulusal ve uluslararası kültür koleksiyonu kuruluşlarından referans olarak kullanılacak S. cerevisiae suşları ((S. cerevisiae ATCC® 9763™, S. cerevisiae ATCC® 6328™, S. cerevisiae 08022 RSK (Refik Saydam Külür Kolleksiyonu)), ulusal ve uluslararası maya üreticisi firmalardan ve ulusal üniversitelerin araştırma laboratuvarlarından çalışmada kullanılan S. cerevisiae suşları temin edilmiştir. Sağlanan tüm bu suşların morfolojik (makroskobik, mikroskobik), biyokimyasal testlerle tanımlanmaları yapılmış ve karşılaştırmalı olarak evrensel DNA barkod dizileri araştırılıp ortaya konmuştur. Bu amaçla toplam 287 izolasyon elde edilmiş bunların 229 tanesi makroskobik ve mikroskobik tanımlamalara göre S. cerevisiae türünün karekteristiklerine uygun bulunmuştur. Elde edilen bu suşlar üzerinde ileri tanımlama olarak Matriks Destekli Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon-Uçuş Zamanlı Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization–Time-Of-Flight Mass Spectrometry) ile cins düzeyinde klasik doğrulama çalışmalarına ek olarak, tür düzeyinde ileri tanımlamalar gerçekleştirilmiştir. MALDI TOF MS ve moleküler tanımlamalar dikkate alındığında 229 izolasyondan 152 adet izolasyon S. cerevisae türü olarak tespit edilmiştir. Elde edilen izolatların tanımlama aşaması sonrasında literatür taramaları doğrultusunda DNA barkodlamada kullanılacak olan gen bölgelerinin tespiti için ITS "Internal Transcription Spacer", LSU "Long Sub Unit", SSU "Short Sub Unit" ve/veya RPB1 "RNA polymerase subunit1", RPB2 "RNA polymerase subunit2", TOP1 "DNA Topoisomerase" gen bölgeleri ile ön PCR "polimerase chain reaction" denemeleri yapılmıştır. Yapılan ön denemelerde uygun bulunan gen bölgelerinin (ITS, LSU, RPB2) DNA barkod yapılarının ortaya konulmasında kullanılmasına karar verilmiştir. Ön tanımlamaları yapılmış olan 2016-2017 izolasyonlarından 120 izolatın DNA ekstraksiyonları yapılmış PCR amplifikasyonları gerçekleştirilmiş ve DNA barkodlarının ortaya konulması araştırmasına bu 120 izolat üzerinden devam edilmiştir. İzolatların PCR amplifikasyonlarının jel elektroforez ayrımlarında ITS gen bölgesinde taksonomik gruplara bağlı ayrımlar görüntülenebilirken, LSU gen bölgesinde bütün izolasyonlar için tek büyüklükte bant ayrımı gözlemlenmiş takson ayrımları jel görüntüleri üzerinden yapılamamıştır. RPB2 gen bölgesi amplifikasyonları jel ayrımında ise her bir izolatta çoklu bant oluşumu gözlemlendiğinden takson ayrımları jel görüntüleri üzerinden yapılamamıştır. RPB2 gen bölgesinde gözlemlenen bu çoklu bant oluşumu sorununun jelden ekstraksiyon yapılarak sekans analizi yapılması sonucu ile aşılabileceği belirlenmiştir. DNA ekstraksiyonu ve ilgili gen bölgeleri için PCR amplifikasyonları yapılan suşların Sanger Sekanslama yöntemi ile dizi analizleri yapılmıştır. ITS gen bölgesi için ortalama 820 baz çifti, LSU gen bölgesi için ortalama 1100 baz çifti, RPB2 gen bölgesi için ortalama 1200 baz çifti içeren sekans verileri DNA barkod tabanlı tanımlamada kullanılmıştır. Suşlardan elde edilen dizi ham verilerinin temizlenmesi FinchTv (https://digitalworldbiology.com/FinchTV) ile yapılmış ve ham veriler ileri veri analizine hazırlanması amacıyla BioEdit programı ile gerekli ön işlemlere tabi tutulmuştur (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Ardından elde edilen veriler üzerinden NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ile karşılaştırmaya dayalı moleküler düzeyde tanımlamalar yapılmıştır. Yapılan tüm tanımlamalar göz önünde bulundurularak, ClustalW programı (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ile izole edilen ve tanımlanan türler arası ve tür içi ilişkiyi ortaya çıkaran filogenetik ağaçlar oluşturulmuştur. Oluşturulan bu filogenetik ağaçlar yardımıyla S. cerevisiae türlerini en iyi tanımlayan barkod bölgeleri belirlenmeye çalışılmıştır. Barkod yapısı olarak kullanılacak motif bölgelerinin belirleme amacıyla MEME-suit programı (http://meme-suite.org/) kullanılmıştır. Elde edilen sekans verileri gen bölgeleri izolasyon sekansları ve barkod sekansları olarak ayrı ayrı değerlendirmeye alınmıştır. Değerlendirmeler sonucunda S.cerevisiae türleri için RPB2 gen bölgesinin izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 98.24, ITS gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 95.83, LSU gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 92.3 ve birleştirilmiş (ITS_LSU_RPB) gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı ise % 95.16 olarak belirlenmiştir. Barkod sekans yapıları kullanılarak ortaya konan filogenetik ayrımda S.cerevisiae türleri için RPB2 gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısının % 100, LSU gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısı % 96.153, ITS gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısı % 95.83 ve birleştirilmiş gen bölgeleri (ITS_LSU_RPB2) barkod yapılarının ayrım başarısı ise % 95.45 olarak belirlenmiştir. Gen bölgelerinin ayrışma katsayıları, izolasyon sekansları ve barkod yapıları için sırasıyla (ITS, LSU, RPB2, ITS_LSU_RPB2) 0.848±0.01, 0.157±0.002, 0.427±0.011, 0.412±0.008 ve 0.873±0,01, 0.725±0.017, 0.7636±0.0136, 0.412±0.008 olarak belirlenmiştir. Barkod sekansı kullanımı ITS bölgesi için büyük bir ayrım gücü farklılığı yaratmazken, LSU ve RPB2 gen bölgeleri için etkili ayrım gücü farklılığı oluşturduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak S. cerevisiae maya türünün tanımlamasında ITS, LSU ve RPB2 gen bölgelerinin başarılı bir şekilde kullanılabileceği ve MEME-suit programı ile elde edilen barkod yapılarının bu ayrımı daha başarılı sağlayabildiği gözlemlenmiştir. Fakat elde edilen barkod yapılarının S. cerevisiae türü için izolasyon kaynağı ve yılı yönünden ayrım yapma konusunda anlamlı homojen bir ayrım gerçekleştiremediği belirlenmiştir. İzolasyonlarla ilgi elde edilen tüm araştırma bilgileri bir veritabanında ("www.dnabarcodefoodomics.com") kayıt altına alınmıştır. Sonuç olarak DNA barkod bilgilerinin oluşturulması, kayıt altına alınması ve böylece bu konudaki bilgiye hızlı erişim sağlanması, önemli bir uluslararası maya üreticisi olan ülkemizde bu alanda rekabet edebilme gücüne katkı sağlaması yönünde bir katkı sağladığı düşünülmektedir.