Sahadan izole edilen Pasteurella multocida serogrup B'ye karşı inaktif aşı geliştirilmesi

Pasteurella multocida, Pasteurellaceae familyasından Gram-negatif bir kokobasil olup çiftlik hayvanlarında, özellikle de sığır ve koyunlarda ciddi enfeksiyonlara neden olmaktadır. Büyükbaş hayvan ölümlerinin yaklaşık % 20' sinden izole edilmektedir. Bu durum, hayvansal üretimi olumsuz yönde etkileyerek pek çok ülkede ciddi ekonomik kayıplara yol açmakta ve önemli bir sorun teşkil etmektedir. Fırsatçı patojen olup, sağlıklı hayvanların solunum yollarında saprofitik olarak bulunurlar. Konağın bağışıklık sistemi zayıfladığında hemorajik septisemi, tavuk kolerası, atrofik rinit, enzootik buzağı pnömonisi ve nakliye ateşi gibi ciddi durumlara yol açmaktadır. Bu çalışma, Pasteurella multocida ve virülans genlerinin karakterizasyonunu yapmak ve serogrup B'ye ait inaktif aşının farklı uygulama yolları ile immünojenitesini değerlendirmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Türkiye'nin farklı bölgelerinden laboratuvara teşhis amacıyla gönderilen/ getirilen, solunum yolu belirtileri gösteren sığır (n=130), koyun (n=70), keçi (n=45) ve evcil kuştan (n=5) toplam 250 örnek ile çalışıldı. Örneklerin 167'si, sığır (n=97), koyun (n=40) ve keçi (n=30) akciğerlerinden; geri kalanı (n=83) sığır (n=33), koyun (n=30) ve keçilerden (n=15) ve evcil kuşların (n=5) burun sürüntüsü olarak alındı. Primer izolasyon prosedüründe % 5 kanlı agar kullanılarak numunelerden etken izalosyonu yapıldı. Bakteriyolojik kültür sonucunda; izole edilen 27 adet (%8,4) P. multocida suşu PZR ile doğrulandı. PZR ile pozitifliği belirlenen P. multocida suşları; 19 farklı virülans geni (dış membran, fimbriae antijen genleri, somatik antijen genleri ve demir bağlama genleri) üzerinden PZR ile analiz edilerek tiplendirildi. Şüpheli P. multocida izolatları için kmt1 geni yönünden PZR yapıldı. Farklı kaynaklardan izole edilen suşların % 57,12'si sığır (12), %23,8'si koyun (5), %14,28'i keçi (3) ve % 4,8'i evcil kuşlardan (1) oluşmaktadır. Tiplendirme için önce kapsu genleri (cap B ve cap E) yönünden çalışıldı. Daha sonra plpB, tadD, gatG, hgbA, ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB ve exbB genleri yönünden incelendi. İzolatların hiçbiri ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB ve exbB'ye sahip değildi. Sığırlardan izole edilen iki cap B örneği virülans gen profili açısından birbirine benzerdi. Aday aşı bakteri suşu (CapB+, plpB+, tadD+, gatG+, hgbA+) BHI buyyonda 37 °C'de 48 saat inkübe edilerek yaklaşık 1×10⁹ cfu/ml bakteri yoğunluğunda üretildi. Kanlı agarlara ekim yapılarak saflık kontrolü yapıldı. Formalin (%0,05) ile inaktive edildikten sonra PBS ile santrijüj (20 °C'de 2000 × g'de 20 dakika) edilerek 3 kere yıkandı. Bakteri peleti, McFarland (No: 4) ile 1x109 cfu / 1 ml olacak şekilde PBS içinde yeniden süspanse edildi. Aday aşı, bakteri süpansiyonu (20 ml) ve Montanide ISA 206VG (Seppic-Fransa) adjuvanı (20 ml) ile homojenize edilerek hazırlandı. Hazırlanan aday aşı, farelere iki farklı aşılama yolu (subkutan-SC ve intramüsküler-IM) ile (0, 30 ml) uygulandı. Fareler 21 gün sonra tekrar aşılandı. Aşılı ve aşısız hayvanlardan 0., 21. ve 35. günlerde kan örnekleri alındı. Hayvan gruplarının seropotensi, indirekt ELISA testi (450nm) ile ölçüldü ve OD₄₅₀ verileri, kontrol grubu ile karşılaştırıldı. SC aşılama grubunda ortalama OD₄₅₀ değeri 0,575 bulunurken, IM aşılama grubunda OD₄₅₀ değeri 0,503 bulundu. Her iki grupta da cut-off değerin 0,323 civarındadır (Şekil 3.8). Beş hafta sonra, SC grupta yüksek antikor düzeyi (OD₄₅₀:1, 0961) korurken, IM grupta genel olarak antikor titrelerinde (OD₄₅₀: 1.042) daha hızlı bir artış görüldü. Elde edilen veriler varyans analizi ve Duncan'nın çoklu aralık testi (p<0.05) kullanılarak hesaplandı. Aşılı fareleri 1×108 (0.3 ml'lik enjeksiyon = 3×107/cfu) canlı patojen P. multocida serotip B ve serotip E suşları intraperitoneal yolla enjekte edilerek çelınç yapıldı. Serotip B ile çelınç yapılan farelerin tümü hayatta kalırken, serotip E ile çelınç yapılan farelerin tamamı 48 saat içerisinde öldüler. Bu çalışmada, P. multocida'nın diğer türlere kıyasla sığırlardan daha sık izole edildiği ve B serogrubu suşlarının daha az virülens genleri taşıdığı belirlendi. İnaktif P. multocida serogrup B aday aşısının, seropotens olarak iyi bağışıklık oluşturduğu, aşının serogrup E suşuna karşı koruma sağlamadığı çapraz korumanın olmadığı tespit edildi. Bu durum, daha geniş koruma için aşı formülasyonlarına birden fazla serogrubun dahil edilmesi gerektiğini düşündürmektedir.