Gynogenesis induction and doubled haploid plant production in sugar beet (Beta vulgaris)

Tezin ilk bölümü kısa bir giriş ve genel bir literatür taramasını içermektedir. Yaklaşık %1.6 ekstrakte edilebilir bir şeker oranına sahip olan şeker pancarından şeker, ilk olarak 1747'de elde edilmiştir. İki yüzyıldan fazla bir süre boyunca, araştırmacıların girişimleri, bitkideki şeker oranını %20'ye kadar arttırmış, ve bu başarının büyük çoğunluğu ise geleneksel ıslah yöntemlerine atfedilmiştir. 19. yüzyılın başlarında, kendiliğinden oluşan ilk haploid şeker pancarı bitkisi keşfedilmiştir. Katlanmış haploid tekniği, yüksek değere sahip tam bir homozigot bitki sağlar ve iki yıllık bitkilerin ıslah sürelerini yaklaşık on yıldan iki yıla kadar kısaltır. Bununla birlikte, haploid bitki üretim tekniği 1945'ten itibaren, biyotik veya abiyotik streslere karşı direnç veya tolerans özellikleri gibi, şeker konsantrasyonu dışındaki diğer faydalı özelliklere sahip bitkilerin üretimi için yaygın olarak kullanılmıştır. Bir çok haploid üretim yöntemi denemiş olup, bunlar in vivo ve in vitro yöntemler olarak kategorize edilmişlerdir. En yaygın yöntem olan androgenezis çoğunlukla haploid veya katlanmış haploid bitki yerine daha çok kallus veya diploid bitkiler elde edilmesi ile sonuçlanmıştır. Ginogenezis dışında, uygulanan yöntemlerin hiçbiri umut verici olmamış, bu nedenle, şeker pancarı ıslah programlarında kullanılacak katlanmış haploid bitkilerin üretimi için tek seçenek ginojenez olmuştur. Şeker pancarı, kendine döllenen allogam bir bitkidir. Dolayısı ile, farklı çeşitler ve genotipler arasında önemli genetik bir varyasyon her zaman vardır. Bilimsel literatürde bildirilen mevcut yöntemler her şeker pancarı genotipi için başarıyla uygulanamayabilir. Şeker pancarı; Almanya, Hollanda, Danimarka veya İsveç batı ülkelerinden şeker pancarı tohum ithal eden Türkiye de dahil olmak üzere, kuzey yarımkürenin ılıman bölgelerinde bulunan tüm ülkeler için ekonomik olarak önemli bir üründür. Ülkemizde sürdürülebilir bir şeker pancarı üretimi yapabilmek için, ülkenin gerekli tohumları ve yerel olarak adapte edilmiş genotipleri ıslah etmesi ve üretmesi gerekir. Bu nedenle, bu tez çalışması, on yıldan daha uzun bir süre önce başlatılan ve hala devam eden iki parçalı bir ıslah programı arasında bir köprü olarak başlatılmıştır. Bu tez kapsamında, dört bölüm halinde sunulan deneylerin amacı, in vitro kültürü yoluyla döllenmemiş ovüllerden haploid şeker pancarı indüksiyonunu (Bölüm II); ginogenik eksplantların hiperhidrisitesinin iyileştirilmesini (Bölüm III); katlanmış haploid şeker pancarı üretimini (Bölüm IV); ve katlanmuş haploid eksplantların çoğaltım oranının arttırılmasını (Bölüm V) sağlamak olup, bu bölümler aşağıda özetlenmiştir. İkinci bölümde, şeker pancarında haploid embriyo indüksiyonunu artırmaya yönelik olarak, çiçek salkımının bir hafta veya daha uzun süre 4 ℃'de tutulması ile farklı 6-benzilaminopurin (BAP) konsantrasyonları (1 veya 2 mg L−1) arasındaki interaksiyonu inceleyen bir protokol tanımlanmıştır. Ovüller, döllenmemiş çiçeklerden izole edilmiş ve in vitro ortam üzerinde kültüre alınmışlardır. Genotip, soğuk ön işlemi ve hormon uygulamaları olmak müzere üç farklı değişken arasındaki etkileşim incelenmiştir. Taze kültüre alınmış ovüller ile karşılaştırıldığında, bir hafta boyunca soğuk ön uygulaması, haploid bitki indüksiyon oranını neredeyse iki katına çıkarmıştır. Hormon içermeyen besiyeri ile kıyaslandığında, 2 mg L−1 BAP takviyesi, kültüre alınmış ovüllerin indüksiyon oranını neredeyse ikiye katlamış, bunu 1 mg L−1 BAP takip etmiştir. En yüksek ginogenez oranını, 2 mg L−1 BAP'nin bir haftalık soğuk ön uyugulama ile kombinasyonu sağlamıştır fakat hormone uygulaması hiperhidrisiteye yol açmıştır. Genotipler arasında uygulamalara verdikleri tepkiler açısından önemli bir varyasyon gözlenmiştir. Genotip ve soğuk ön uygulama arasında da önemli bir etkileşim gözlenmiştir. Taze kültüre alınmış ovüller (yani kontrol) ile karşılaştırıldığında, bir haftadan daha uzun süreli (2-5 hafta) soğuk ön işlem uygulaması benzer veya daha düşük oranda ginogeneze yol açmıştır. Bir hafta soğuk ön işlemi ve 1 mg L−1 BAP uygulanmış genotiplerden birinin (SG3) ovülleri en yüksek oranda rejenerant üretmiştir. 1 veya 2 mg L−1 BAP içeren ortamlardaki ginogenez oranları, kontrole göre sırasıyla 1.7 ve 2 kat artış göstermiştir. Bir haftalık soğuk ön uygulaması, haploid embriyo indüksiyonu oranını %6.49'dan %11.3'e yükseltmiştir. Üçüncü bölüm, farklı konsantrasyonlarda BAP veya kinetin (Kin) hormonları, sükroz ve bir katılaştırıcı madde olan Phytagel'i içeren ortamların haploid şeker pancarı eksplantlarının çoğaltımı ve hiperhidrisitesi üzerindeki etkilerini içeren çalışmaları tanımlamaktadır. Haploid embriyoların uyarılması ve ilk üretim sürecini takiben, eksplantlar altı hafta boyunca yukarıda belirtilen kimyasalların on farklı konsantrasyonunu içeren ortamlarda denenmiştir. Uygulamalardan sonra, eksplantların proliferasyon ve hiperhidrisite ortalamaları karşılaştırılmıştır. Kabul edilebilir oranda proliferasyon ve minimum düzeyde hiperhidrisiteye yol açan Kin'nin, farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda uygulanan BAP'den daha iyi performans gösterdiği gözlenmiştir. En az hiperhidrisite ve en yüksek proliferasyon, 0.2 mg L−1 Kin, 10 g L−1 sükroz ve 6.5 mg L−1 Phytagel uygulandığında elde edilmiş olup, değişkenler arasında negatif bir korelasyon (τb = −.648, n = 36, p <.001) gözlenmiştir. Dördüncü bölümde, haploid şeker pancarı bitkilerinin sayısının artırılmasında ve ardından kromozom sayısının iki katına çıkarılmasında oldukça etkili olan bir protokolün detayları sunulmuştur. Bu bölümde, haploid embriyo indüksiyonunu artırmak amacıyla, soğuk ön uygulaması, yedi farklı şeker pancarı genotipi ve Kin arasındaki etkileşim incelenmiştir. Ayrıca, ovüllerin renginin, çiçek tomurcuğunun çiçek salkımı üzerindeki pozisyonunun ve virgül-şeklindeki ovülün haploid embriyo indüksiyonu üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bir hafta ön soğuk uygulaması, Kin takviyesi ve genotipler, ovüllerin uyarılmasında etkili olmuştur. Çiçek tomurcuk pozisyonu, ovül rengi ve virgül-şeklindeki ovülün ginogenik tepki üzerindeki etkileri anlamlı bulunmuştur. Değişkenlerin iki yönlü ve üç yönlü etkileşimlerinin de istatistiksel olarak anlamlı oldukları tespit edilmiştir. Kontrol ile karşılaştırıldığında, 0.05 veya 0.5 mg L−1 Kin, anlamlı şekilde daha fazla sayıda ginogenik embriyo indüksiyonu oluşturmuştur. Ginogenik embriyo indüksiyonunda en çok ve en az yanıt veren genotipler arasındaki fark yaklaşık 4 kat olmuştur. Soğuk ön uygulama ve Kin arasındaki etkileşimin etkisi 0.05 mg L−1 Kin kullanıldığında en belirgin şekilde gözlenmiştir. Bununla birlikte, yeni kültüre alınmış ovüler için Kin'nin etkisi istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Hormonal uygulamaların genotipler üzerindeki etkileri farklı olmuş, örneğin SG5 genotipi 0.5 mg L−1 Kin'de yüksek oranda indüksiyona (%24) ulaşmış fakat başka bir genotip (örneğin SG4), hormonal uygulamaların hiç birine cevap vermemiştir. Çiçek salkımı üzerindeki ovül pozisyonunun etkisi incelendiğinde, çiçek salkımının alt kısmı üzerinde büyüyen çiçeklerden çıkarılan yumurtların, üst kısmından çıkarılanlara göre daha verimli oldukları ve daha fazla ginogenik embriyo ürettikleri görülmüştür. Bir ay sonra kahverengiye dönen övüller, beyaz rengini koruyan ovüllerle karşılaştırıldığında daha yüksek oranlarda ginogenik embriyo ürettikleri gözlenmiştir. 3 veya 7 dakika uygulandığında düşük miktarlarda katlanmış haploid bitki ürettiğinden, bu oranı artırmak için 5 g L−1 kolşisin 5 dakika süreyle uygulanmıştır. Bununla birlikte, kromozom katlanması işleminde gözlenen genotipik varyasyon önemli bulunmamıştır. Beşinci bölümde, katlanmış haploid bitki üretimini arttırmak amacıyla, beş prolin seviyesinin (0.0, 0.1, 0.2, 0.3 veya 0.4 mM) eksplantların proliferasyonu, çoğaltımı ve sürgün uzunluğu üzerindeki etkileri karşılaştırılmıştır. Prolin, 0.2 mg L−1 Kin, 10 g L−1 sakaroz ve 6.5 mg L−1 Phytagel içeren ve III. Bölümde en başarılı uygulama olarak belirlenen (HT9) ortamına ilave edilerek denenmiştir. 0.3 mM prolin uygulaması, en yüksek proliferasyona ve çoğaltıma, prolin içermeyen ortam ise en düşük proliferasyona ve en düşük çoğaltım oranlarından birine yol açmıştır. 0.3 mM prolin en kısa sürgün boyunu, 0.1 mM prolin ise en uzun sürgün boyunu yol oluşturmuştur. Prolifere olan eksplantlar, çoğaltım için oldukça uygun bulunmuşlardır (τb = 0.822, SE = 0.027, n = 75, p < 0.001). Bununla birlikte, hem proliferasyon hem de çoğaltım negatif bir korelasyon göstermiştir (sırasıyla, τb = –0.565 and –0.601, SE = 0.061 and 0.054). Sonuçlarımız prolinin şeker pancarının in vitro proliferasyonu ve çoğaltımı üzerindeki olumlu etkilerini ilk defa ortaya koymaktadır. Altıncı bölüm genel sonuçları içermektedir. Özetle, haploid bitki indüksiyon oranının, 4 ℃'de bir hafta boyunca çiçeklerin soğuk ön uygulamasıyla artırılabilir. Diğer taraftan, BAP takviyesi daha fazla ginogenezi indükleyebilir. Bununla birlikte, yüksek BAP dozları, gelişen yapılarda hiperhidrisite ve nekroz gibi anormal gelişmeleri tetikleyebilir. Tanımlanan yöntem oldukça genotipe bağımlı görünüyor. Kin, hiperhidrik olmayan bitkileri uyarmada BAP'dan daha iyi bir alternatif gibi görünmektedir. Ovule rengi ve çiçek tomurcuğunun çiçek salkımı üzerindeki yeri, ginogenezde istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. 0.4 mM prolin, şeker pancarının in vitro büyümesine zararlı olmuş ama 0.3 mM'deki prolin daha fazla proliferasyon sağlamıştır. Her ne kadar 0.1 mM prolin daha az etkili olsa da, prolin içermeyen besiyerine kıyasla daha iyi proliferasyon ve çoğaltım oranlarının elde edilmesini sağlamıştır. En uzun sürgünler 0.1 mM prolin içeren ortamda elde edilirken, en kısa sürgünler 0.3 mM prolin içeren ortamda elde edilmiştir.