Development of anti-diabetic living drugs via synthetic biology approach

Tip 2 Diyabet (T2DM), insülin direnci ve bozulmuş glikoz regülasyonu ile karakterize yaygın bir metabolik hastalıktır. GLP-1 ve analoğu Exendin-4 gibi peptit bazlı ilaçlar, insülin salgısını artırmaları ve glisemik kontrolü iyileştirmeleri nedeniyle klinik tedavide yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bu peptitlerin kısa yarı ömürleri, sindirim sistemindeki enzimatik yıkıma uğramaları ve tekrarlayan enjeksiyon gereksinimi, tedavi etkinliğini ve hasta uyumunu sınırlamaktadır. Bu zorlukların üstesinden gelmek amacıyla, bu çalışmada bağırsak ortamına duyarlı olarak anti-diyabetik peptit üretimi yapabilen mühendislik ürünü bir probiyotik sistem geliştirilmesi hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, fizyolojik olarak anlamlı uyarıcılara (yağ asitleri, safra tuzları ve aspirin) yanıt verebilen tam hücre biyosensörleri, sentetik düzenleyici elemanlar kullanılarak tasarlanmıştır. Bu biyosensörler, doz-tepki davranışlarını belirlemek amacıyla sfGFP floresan raporlayıcı geninin ekspresyonu ile karakterize edilmiştir. Başarılı karakterizasyondan sonra, raporlayıcı gen çıkarılarak yerine GLP-1 veya Exendin-4 kodlayan diziler, farklı salgı sinyal peptitleri (PhoA, MalE, TorA, DsbA, PelB) ile füzyonlanarak klonlanmıştır. Klonlama süreçlerinde Gibson Assembly ve klasik moleküler biyoloji teknikleri kullanılmıştır. Ortama salgılanan peptitlerin fonksiyonelliği, ELISA ile yapılan kantifikasyon ve MIN6 hücre hattı kullanılarak yapılan biyolojik fonksiyon testleri ile değerlendirilmiştir. Hücre canlılığı için MTT analizleri, biyolojik aktiviteyi belirlemek için ise glikozla uyarılmış insülin salınımı testleri gerçekleştirilmiştir. Denenen yapılar arasında, sinyal peptitleri ile füzyonlanmış GLP-1 ve Exendin-4 versiyonlarının hücre canlılığı ve insülin salınımı üzerinde anlamlı etkiler gösterdiği tespit edilmiştir. Bu durum, terapötik peptitlerin başarılı şekilde üretildiğini ve işlevsel olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, metabolit yanıtlı gen devreleri ile mühendislik ürünü probiyotik bakterilerin bir araya getirilerek hedefe yönelik peptit salınımı yapılabileceğini göstermektedir. Geliştirilen bu platform, konak ortamına duyarlı ve kendi kendini düzenleyen tedavi sistemleriyle metabolik hastalıklar için yeni nesil yaşayan ilaçların geliştirilmesinde umut vadeden bir strateji sunmaktadır.