Investigation of physiological roles of strigolactones in sugar beet (Beta vulgaris L.) under in vitro tissue culture and ex vitro abiotic stress conditions

Karotenoidlerden kökenlenen ve yeni nesil hormonlar olarak bilinen strigolaktonlar (SL), kök ve gövde oluşumunu düzenleyici, Striga, Orobanche ve Phelipanche gibi kök paraziti bitkilerin çimlenmesini uyarıcı, besin stresine karşı kök ve gövde oluşumunu düzenleyici, metabolik ve çevresel uyarıcılara tepki ve savunma mekanizmalarında etkili, ve sekonder büyümeyi teşvik eden bitki büyüme düzenleyicileridir. Bu bitki hormonları sınıfının, büyüme ve gelişmede çeşitli biyolojik rolleri olduğu için, şeker pancarında (Beta vulgaris) henüz tanımlanmamış sorumlu genlerin belirlenmesi, daha iyi ve üretken genotiplerin seçilmesi, veya in vitro olarak manipüle edildikten sonra, bu son derece önemli ve endüstriyel bitkinin üretimi için değerli bir bilgi sağlayacaktır. Öte yandan, tuzluluk ve kuraklık gibi çevresel stresler, bitki büyümesi üzerindeki olumsuz etkilerinden dolayı bitki verimliliğinde düşüşe yol açmaktadır. Farklı fitohormonlar stres tepkilerine katılır; ancak, bu önemli açıdan strigolaktonların (SL) rolü henüz açıklanamamıştır. Yukarıda belirtilen öneme ek olarak, SL'lerin in vitro şeker pancarı kültüründeki rollerinin açıklanması, doku kültürü yöntemlerinde ve belirli aşamaların optimizasyonunda daha büyük bir başarıya katkıda bulunabilir. Daha fazla bilgi için, tezin Giriş bölümünün okunması önerilir (Bölüm I). Bu nedenle, bu tez, MAX1 geninin SL'lerin biyosentezindeki veya sinyallemesindeki rollerini değerlendirmek ve şeker pancarında ilk kez sorumlu geni önermek/tanımlamak için hazırlanmıştır (Bölüm II). Bu, SL'lerin, dünyadaki bitki üretimi için inkar edilemez sorunlardan biri olan abiyotik stresler altında olumsuz etkilenen bitki koşullarının hafifletilmesine nasıl katkıda bulunabileceğini tahmin etmeyi içerecektir (Bölüm III). Ek olarak, tez çalışmasının bir bölümü, şeker pancarının doku kültürü üzerindeki çimlenmeden kök büyümesine kadar SL'lerin etkilerini araştırmaktır (Bölüm IV ve V). Bir sonraki amaç, SL'ler ile oksin arasındaki ilişkiyi hormonal bir etkileşim olarak incelemektir (Bölüm VI). Ek olarak, bu bulguların abiyotik stres toleransı yüksek bitki çeşitlerinin geliştirilmesine yönelik tarımsal araştırma faaliyetlerine katkıda bulunacağı da ümit edilmektedir. II. Bölümde, şeker pancarındaki MAX1 geninin olası ortolojisinin değerlendirilmesi için bir deney tanımlamıştır. Strigolakton hormonlarının (rac-GR24, (±) -strigol ve (±) -5-deoksistrigol) ve bir SL inhibitörünün (TIS108), Beta vulgaris subsp. vulgaris sitokrom P450 711A1 ekspresyon düzeyi üzerine etkisi çalışılmıştır. Bu gen ve referans gen (β-aktin) için birkaç farklı primer çifti kümesi, ilgilenilen genin ekspresyon seviyesini kantitatif olarak tahmin etmek için tasarlanmıştır. Ana deneylere başlamadan önce, ana deneyin fizibilitesini ve güvenilirliğini kontrol etmek için bir takım ön deneyler yapıldı. Püskürtme koşullarını kontrol etmek ve moleküler sonuçların kalitesini ve miktarını incelemek için ön deneyler yapıldı. Ön deneylerin sonuçları oldukça ümit verici olmuş, sonrasında ana deneyler yapılmıştır. Eksojen olarak uygulanan SL'lerin ilgilenilen genin ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, şeker pancarı cv. Serenada tohumları saksılara ekildi. Dört seviye (0, 2.5, 5 ve 7.5 M) kimyasal (rac-GR24, strigol, 5-deoksistrigol ve TIS108), her iki günde bir kez yedi kez, her seferinde 5 veya 10 ml ile püskürtülmüş, işlemler uyguladıktan sonra, bitkilerin yaprak örnekleri toplanmış, toplam RNA'ları çıkarılmış, cDNA'lar sentezlenmiş ve genin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler BioRad CFX connect Real-Time PCR cihazı kullanılarak kantitatif bir PCR (qPCR) yöntemine göre araştırılmıştır. qPCR analizinden elde edilen sonuçlar SL hormonlarının eksojen uygulamasının gen ekspresyonunu azalttığını göstermiştir. Öte yandan, SL inhibitörünün uygulanması ilgilenilen genin ifadesini arttırmıştır. Genel olarak, genin ekspresyonundaki azalma ve artış, uygulanan kimyasalların konsantrasyonları ile sırasıyla ters ve doğrudan orantılı olmuştur. Bölüm III, SL'lerin eksojen uygulamasının, saksıda yetişen tuzluluk ve kuraklığa strese maruz kalan şeker pancarı bitkileri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tasarlanmış bir deneyi anlatmaktadır. Toprağın özelliklerini analiz ettikten sonra, şeker pancarı bitkilerinin farklı tuzluluk seviyelerine ve kuraklık streslerine karşı tepkilerini değerlendirmek için bir ön deney yapılmıştır. Tuzluluk öncesi deneyi, saksı bitkilerinin, 50 gün boyunca 150 ml, 200 mM veya 250 mM içeren sulu bir NaCl çözeltisi ile sulanmasıyla gerçekleştirildi. Kuraklık öncesi deney, dört, altı veya sekiz gün boyunca sulamayı keserek gerçekleştirildi. Ön deneylerden gözlemlenen sonuçlar, 250 mM NaCl'nin ve altı gün boyunca sulamanın durdurulduğu koşulların asıl deneylerin yapılması için uygun olduğunu göstermiştir. Asıl deneyler için, on günlük fidelere iki hafta boyunca günde bir veya iki kez 10 M hormon (rac-GR24, St ve dSt) püskürtülmüştür. Sürgün numunelerinin toplanmasından sonra, morfoloji, katalaz (CAT) enzim aktivitesi, klorofil (Chl) içeriği ve malondialdehit (MDA) içeriği üzerindeki etkileri su püskürtülmüş kontrol bitkileriyle karşılaştırılmıştır. Asıl deneyler yapıldıktan sonra bitkilerin gözlemlenmesi, tüm hormonal işlemlerin bitkilerin tuzluluk ve kuraklık streslerine karşı toleransını arttırdığını göstermiştir. Genel bir bakış açısına göre, Chl a ve toplam Chl (Chl T) miktarının arttırılması üzerindeki hormonal uygulma etkileri önemliyken, Chl b üzerindeki etkileri anlamlı değildi. Bununla birlikte, strese maruz kalan bitkilerde CAT enzim aktivitesi üzerindeki hormonal uygulama etkileri istatistiksel olarak anlamlı değildi. Öte yandan, hormonal uygulamalar genellikle bitkilerde MDA miktarını azaltı. Bölüm IV, SL hormonlarının şeker pancarı tohumlarının çimlenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için önerilen bir yöntemi açıklamaktadır. Uygulanan hormonal uygulamalar, yarı kuvvetli bir MS ortamına eklenmiş ve 10 g L-1 sukroz ile takviye edilmiş, rac-GR24, St, dSt ve TIS108 olmuştur. Hormonal uygulamaların konsantrasyonları 0 (kontrol), 2.5, 5 ve 7.5 M idi. Deney, in vitro koşullarda yapıldı. Hormon içeren ortamda tohumların ekiminden on dört gün sonra, çimlenmiş tohumların yüzdesi hesaplandı. Sonuçlar, hormonal uygulamaların şeker pancarı tohumunun çimlenmesi üzerindeki etkilerinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığını göstermiştir. Bölüm V, SL'lerin şeker pancarının in vitro doku kültürü üzerindeki etkilerini inceleyen bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu deneyde, tohumları çimlendirmek için, hazır ortam olarak yarı-kuvvetli bir MS kullanılmıştır. Tohumların in vitro ortamda çimlenmesinden sonra, eksplantlar, 30 g L-1 sukroz, ve 0 (kontrol), 2.5, 5 ve 7.5 M rac-GR24 içeren tam güçte MS ortamı içeren bir ortam üzerinde alt kültüre alındılar. Kültür başlangıcından bir ay sonra, sürgün oluşumu ve kök büyümesi gözlendi. Şeker pancarı eksplantlarına rac-GR24 uygulanması, yaprak sayısını, toplam yaprak uzunluğunu ve toplam yaprak alanını önemli ölçüde azalttı. Benzer şekilde, in vitro ortama rac-GR24 ilavesi, şeker pancarı eksplantlarındaki kök uzunluğunu azaltmıştır. Ölçülen parametrelerdeki düşüş istatistiksel olarak anlamlıydı ve ortamdaki rac-GR24 konsantrasyonu ile ters orantılıydı. Bölüm VI, SL'nin oksin ile etkileşimlerini in vitro koşullarda incelemek için bir protokol tanımlamaktadır. Ortamdaki tohumların çimlenmesinden sonra, eksplantlar, 30 g L-1 sukroz ile takviye edilmiş, ancak çeşitli miktarlarda SL ve oksin hormonları (rac-GR24 ve IAA) ve SL ve oksin inhibitörleri (TIS108 ve TIBA) içeren tam kuvvetli bir MS ortamı içeren bir ortamda alt kültüre alındılar. Kimyasalların toplam yedi farklı kombinasyonu hazırlandı. Kültürün başlamasından dört hafta sonra, farklı bitki büyüme düzenleyicilerinin etkileşiminin yaprak sayısı, yaprakların uzunluğu, yaprakların alanı, şeker pancarı eksplantlarındaki köklerin uzunluğu üzerindeki etkileri gözlenmiştir. Uygulamaların etkileri istatistiksel olarak anlamlıydı. En yüksek yaprak sayısı ve en uzun yaprak, kontrol, TIS108 ve TIS108 + IAA uygulamalarında gözlenirken, en düşük veriler TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 içeren uygulamalarda kaydedilmiştir. . En büyük yaprak alanı kontrol ve TIS108 uygulamaları için kaydedildi. En küçük alanlar TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 içeren ortamlarda elde edildi. Kontrol koşullarında yetişen şeker pancarı eksplantları en uzun kökleri oluştururken, en kısa olanları TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 ile desteklenmiş ortamlarda kültüre alınan eksplantlar için kaydedilmiştir. Kontrol, TIS108 ve TIS108 + IAA uygulamaları en fazla kök üretti, ancak diğer uygulamalar en az kök sayısına neden oldu. Bölüm VII, bu araştırma tezinde açıklanan deneylerden elde edilen sonuçları içermektedir. Şeker pancarındaki (B. vulgaris) incelenen genin (cytochrome P450 711A1) Arabidopsis'te MAX1 geninin bir ortologu olduğu görülüyor. Gen, muhtemelen şeker pancarı içindeki SL'lerin biyosentez yolunda rol oynamaktadır. Ek olarak, SL'ler, şeker pancarı sürgün ve köklerinin mimarilerinin in vitro koşullarda değiştirilmesinde etkilidir. SL'lerin, in vitro şeker pancarı eksplantlarının büyümesi üzerinde inhibe edici bir etkisi olduğu görülmektedir. SL'ler şeker pancarı bitkileri için tuzluluk ve kuraklık koşullarının zararlı etkilerini hafifletebilir gibi görünüyor. Ayrıca, SL'lerin doğrudan ve oksinden bağımsız olarak hareket edebildiğini göstermektedir.