Investigations of the structure function relationship of cryptochrome in unicellular organisms

Işık algı reseptörleri canlıların çevreden ışık bilgisini almakla görevlidirler. Doğada gerçekleşen ışık değişimlerine göre canlılar kendilerini adapte edip, metabolizmalarını optimize ederler. Fotoliyaz /Kriptokrom genleri DNA tamiri ve mavi ışık reseptörü olarak çalışan geniş ve farklılaşmış bir gen ailesidir. Bu aile yaygın olarak yaşamın üç alemindeki canlılarda bulunur. Üç ana kategoriden oluşan bu aile; 1) Siklobütan pirimidin dimer fotoliyaz (CPD-Fl), 2) [6-4] fotoliyaz ([6-4] Fl) ve 3) kriptokrom (Kri) proteinlerinden oluşur. Fotoliyazlar ışık enerjisini kullanarak DNA üstündeki ultraviyole ışının yarattığı hasarları tamir eden enzimlerdir. Buna karşın kriptokromlar, bitki ve hayvanlarda sirkadyen ritmi düzenlemek gibi çeşitli biyolojik olayları kontrol eden sinyal molekülleri olarak çalışırlar. Yüksek canlılarda fonksiyonları tanımlanmış olsa da kriptokromların tek hücreli canlılardaki rolleri belirli değildir. Evrimsel açıdan bakıldığında, basit canlılardaki kriptokromlar bitki ve hayvanlardaki kriptokromların atası olabilme ihtimalini taşımaktadırlar. Sonuç olarak, fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait genleri kodlayan tek hücreli genomlarından bu aileye ait yeni proteinler keşfetmek kriptokromun yapı-işlev ilişkisini ve farklı canlılarda farklı fonksiyonlara sahip olabilmesinin altında yatan yapısal değişiklikleri anlamak açısından önem taşır. Bu amaçla, bu tezde tek hücreli canlılarda bulunan kriptokromlar yapı-işlev ve kinetik ilişkisi yönünden biyokimyasal, komplementasyon ve yüzey plasmon rezonans spektroskopi yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Bu çalışmada, bir kırmızı alg olan Cyanidioschyzon merolae'ye ait fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait yedi tane yeni gen tanımlanmıştır. Evrimsel sınıflandırmada kırmızı alge ait fotoliyaz benzeri bu genlerden bir tanesi [6-4] fotoliyaza benzerlik gösterir. Üç tanesi tek zincir DNA üstündeki UV ışın hasarlarını tamir eden ve kriptokromun alt bir grubu olarak sayılan KRİ-DASH proteinleriyle aynı ailedendirler. Bunun yanında iki tane genin bitki kriptokromlarıyla ve bir tanesinin de bitki kriptokromuyla fotoliyaz arasında bağımsız olarak evrimleştiği belirlenmiştir. Biyokimyasal ve komplementasyon verileri C. merolae'nin iki tane işlevsel Kri-DASH proteinine ve bir tane de DNA tamir işlevi olmayan Kri-DASH'e sahip olduğunu kanıtlamıştır. Fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait olan ve ilkel bir canlıda bulunan bu yeni fotoliyaz benzeri genler için yapılan böyle bir fonksiyonel karakterizasyon çalışması, bitki kriptokrom ailesinin ilk ökaryotlardan itibaren oluşumuna, orijinine ve evrimine ışık tutma açısından önemlidir. İkinci olarak, bu tezde V.cholerae Kriptokrom-DASH ve V.cholerae Fotoliyaz enzimlerinin DNA tamiri kinetiği yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile incelenmiştir. Bildiğimiz kadarıyla ilk defa bu çalışmayla V.cholerae Kriptokrom-DASH'in siklobutan pirimidin dimer içeren tek zincir ve çift zincir DNA'ya olan bağlanma isteği sayısal olarak ölçülmüştür. Buna ek olarak, DNA tamir deneylerinin, yine bu çalışmada, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi tekniği ile gerçek zamanlı olarak gözlenebildiği gösterilmiştir