Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 rekombinant fosfotriesteraz homolog proteininin mutasyonla bazı özelliklerinin geliştirilmesi

TÜBİTAK, 109T985 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, pET-28a(+) vektörüne klonlanmış olan Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 fosfotriesteraz homolog protein geni (TK4PHP) üzerinde bölge spesifik mutasyonlar yapıldı. Elde edilen mutant genler Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3)pLysS konakçı hücresinde ekspres edilip, saflaştırıldı. Protein ekspresyonu ve saflaştırma işlemi, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapılarak doğrulandı. Aktivite tayini çalışmalarında genel fosfotriesteraz (PTE) substratlarından paraokson, paratiyon ve malatiyon varlığında herhangi bir aktivite elde edilemezken, denenen esteraz substratları içinde en yüksek aktivite p-nitrofenil asetat (pNPA) varlığında gözlendi. TK4PHP rekombinant enzimi, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 mutat enzimleri için optimum pH 8,0 olarak bulunurken, TK4PHPM3 mutantı için bu değer 8,5 olarak belirlendi. Optimum sıcaklık değerlerinin TK4PHP, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 için 50 °C, TK4PHPM3 için ise 60 °C olduğu görüldü. Km ve Vmax değerleri sırasıyla TK4PHP için 1,27 mM ve 7,59 U/mg protein, TK4PHPM3 için 1,43 mM ve 14,53 U/mg protein, TK4PHPM3-M4 için 0,59 mM ve 3,34 U/mg protein, TK4PHPM3-M4-M5 için ise 0,46 mM ve 4,04 U/mg protein olarak hesaplandı. Rekombinant ve mutant PHP'lerin 4 °C'de, pH 3,0-9,0 aralığındaki tamponlarda ayrı ayrı 7 gün inkübe edilmesiyle, aktivitelerini büyük oranda koruduğu gözlendi. Mutant TK4PHPM3-M4-M5 enziminin, 90 °C'de 7 gün inkübasyon sonunda aktivitesini %75 oranında koruduğu belirlendi. Bu sonuçlar, TK4PHP'sine yapılan mutasyonlarla birlikte, oldukça pH ve ısıl kararlı yeni mutant PHP'lerin endüstriyel uygulamalar için önemli potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir.