Glutatyon enzimlerinin seçici konjugasyonu ile heterojen biyokatalize dair çalışmalar

Biyolojik prosesler kullanılarak birçok katma değerli özel kimyasal üretilmektedir. Bu prosesler verimli, güvenli ve çevre dostu olmakla birlikte; pH ve sıcaklık gibi çevresel parametrelerdeki değişikliklere karşı kırılgan ve hassastırlar. Enzim immobilizasyonu, proteinleri stabilize ederek ve uygun geri dönüşümlerine izin vererek bu endişeleri hafifletebilir. Bununla birlikte, geleneksel yöntemlerle immobilizasyon, birleştirme kimyası üzerinde kontrol eksikliği nedeniyle enzim inaktivasyonu riskini taşır. Hassas konjugasyon ile katalitik biyomalzemelerin/partiküllerin oluşturulması bahsedilen sorunları çözebilir. Bu projede, böyle bir kavram kanıtı katalitik biyomateryal konusunda önemli ilerleme kaydedilmiştir. Konsept, benzersiz reaktif doğal olmayan amino asitler (nnAA'lar) içeren biyosentetik enzimlerin bağlanacağı PEG tabanlı bir yapı iskelesini içerir. Bu amaçla, yüksek değerli antioksidan olan glutatyonun (GSH) biyosentezini katalize eden glutamat-sistein ligaz (GCL) ve glutatyon sentetaz (GS) enzimleri kullanılmıştır. GCL ve GS enzimleri, hücresiz protein sentezi (CFPS) ile üretildi ve Click-uyumlu nnAA para-propargiloksi-fenilalanin (pPaF)'nin bölgeye özgü dahil edilmesiyle modifiye edildi. Modifiye edilmiş protein verimlerini iyileştirmek için CFPS ile ilgili çeşitli parametreler ve şaperonlar gibi eksojen proteinlerin eklenmesi üzerinde çalışıldı. Modifiye edilmiş enzimlerin aktiviteleri, doğal muadillerine kıyasla aktivitelerinin %80'ini korudu. Son olarak, Click kimyası yoluyla PEG eşleşmesini incelemek için modifiye yeşil flüoresan proteini (GFP) kullanıldı. Tezin ikinci bölümünde, Covid-19 ile ilişkili sitokin fırtınasının tedavisinde kullanılmak üzere biyolojik anti-inflamatuar ilaç anakinranın üretimi incelenmiştir. Anakinra, Behçet hastalığı ve ailesel Akdeniz ateşi (AAA) gibi çeşitli iltihaplı hastalıkların tedavisinde kullanılan lisanslı bir biyolojik ilaçtır. İnsan interlökin 1 reseptör antagonisti (IL-1Ra) proteininin bakteri kültürlerinde rekombinant üretimi ile elde edilir. Çalışmanın bir bölümünde anakinra'nın Escherichia coli'de farklı promotörler (T7, tac ve cspA) altında ekspresyonu test edildi. Üretim ve saflaştırmadan sonra, saf ve bozulmamış proteinin, ticari olarak mevcut ilaç ile karşılaştırılabilir düzeyde biyolojik afinite, aktivite, saflık ve güvenliğe sahip olduğu gösterildi. Anakinra üretiminin büyük ölçekli üretime aktarılması için en uygun proses koşulları belirlendi.