A study on RNA and protein effectors of transcription factor activity and gene expression

Transkripsiyon faktörleri, hedef genlerin ifadesini arttırabilir veya baskılayabilir. Bu kritik rolleri sebebiyle transkripsiyon faktörlerinin aktivitesi sağlık ve hastalıkta belirleyicidir. Transkripsiyon faktörü aktivitesi, koaktivatörler, yükseltici (enhancer) RNA'lar ve protein oligomerizasyonu gibi birçok faktörün etkisi altındadır. Burada sunulan araştırmada, işlevsel genomik ve proteomik teknikleri bilgisayar analizleriyle birleştirerek, bu etkenlerin transkripsiyon faktörlerini ve gen ifadesini nasıl etkilediğini araştırdık, ayrıca bir transkripsiyonel baskılayıcının kanserdeki rolünü inceledik. Androjen reseptörünü (AR) bir model transkripsiyon faktörü olarak kullanarak, uzun kodlanmayan yükseltici RNA KLK3e'nin AR tarafından düzenlenen gen ifadesini nasıl etkilediğini karakterize ettik. İn vitro RNA çekimi (pulldown) ardından kütle spektrometresi uygulayarak, KLK3e ile etkileşen proteinleri belirledik. Etkileştiği tespit edilen proteinlerin DDX5, DDX17 ve HSPA8 gibi AR aktivitesini düzenlediği ve prostat kanserinde önemli roller oynadığı bilinen proteinler içermesi dikkat çekti. Sonuçlarımız ve RNA-protein kompleksinin bilgisayar modellemesi, KLK3e RNA'sının AR aktivitesinde olan etkisini, AR koaktivatörlerini transkripsiyon bölgesinde toplayan bir iskele görevi görerek gerçekleştirebileceğini gösterdi. Bu tür RNA iskele etkilerinin benzerleri, diğer nükleer reseptörler ve transkripsiyon faktörlerinde de yer alıyor olabilir. Örneğin östrojen reseptörü ve D vitamini reseptörü de RNA bağlayıcı protein DDX5 ile etkileşmektedir. Sonra, koaktivatör proteinlerin gen transkripsiyon profilini nasıl etkilediğini araştırdık. AR'nin farklı bölgelerine bağlanan ve protein etkileşimlerini bozan dört yeni küçük molekül inhibitör kullandık. Bozulan etkileşimleri saptamak için endojen proteinlerin hızlı immünopresipitasyon kütle spektrometre analizi (RIME) ve gen ifadesinin nasıl etkilendiğini anlamak için RNA sekans analizi uyguladık. Bir koaktivatör bağlanma bölgesinin, dimerizasyonun, DNA bağlanmasının ve ligand aktivasyonun inhibisyonunun benzer sayılarda protein etkileşimini olumsuz etkileyebildiğini gözlemledik. Ayrıca farklı noktaları etkileyen tüm inhibitörler gen ifadesi profilini de benzer şekilde etkiledi ve AR'nin transkripsiyonel aktivitesini düşürdü. Transkripsiyon faktörü oligomerizasyonunu incelemek için glukokortikoid reseptörü (GR) ile in siliko modellemeler yaptık. Deneysel gözlemler GR'nin mineralokortikoid reseptörü (MR) ile etkileştiğini, ve ayrıca DNA'ya bağlandığında homo tetramerler oluşturduğunu öne sürmüştü. Bilgisayar modellemelerimiz, deneysel gözlemlerdeki çeşitliliği açıklayarak GR ve MR'nin, nükleer reseptör ailesindeki yakın akrabaları tarafından paylaşılan çeşitli alternatif arayüzleri kullanarak etkileşime girebileceğini gösterdi. Modellerimiz, ligand veya antagonist bağlanmasının etkileşimi önlemediğini, fakat arayüz tercihini değiştirdiğini gösterdi. Bu şekilde farklı bölgeler farklı koaktivatörlerin bağlanması için açık kalıyor olabilir, ve bu durum farklı ligandların nasıl farklı hücresel sonuçlar doğurduğunu açıklayabilir. Ayrıca ligand bağlama birimi üzerinden GR tetramerizayonunu modelledik. DNA bağlama birimi üzerinden tetramerizasyonun kromozomal döngü modeliyle gerçekleşebileceğini gösterdik. Sirkadiyen saat düzenlemesi de transkripsiyonel faktörlere dayanır. Kriptokrom (CRY) bir sirkadiyen transkripsiyonel baskılayıcıdır ve silinmesinin kanseri geciktirdiği ve p53 mutant farelerin ömrünü uzattığı görülmüştür. p53 mutantlarda kriptokromun silinmesi üzerine UV hasarı tepkisindeki transkriptomik değişiklikleri RNA dizileme analizi ile araştırdık. Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin Gen Kümesi Zenginleştirme Analizi (GSEA), IFN-γ immün sürveyansında ve NF-κB ile TNFα sinyalleşmesinde zenginleşme gösterdi. Protein ağı analizi, p21, Sirt1 ve Jun gibi yeni kilit oyuncular belirledi. Farklı düzeydeki genlerin yüksek oranda kodlamayan RNA içerdiği gözlendi. Kısaca, KLK3e arttırıcı RNA'nın AR ko-aktivatörleri ile etkileşime girdiğini ve ayrıca ko-aktivatör bağlanmasının, AR transkripsiyon aktivitesi üzerindeki etkisinin ligand aktivasyonu, DNA bağlanması ve dimerizasyonun engellenmesiyle benzer olduğunu gösterdik. Yapısal modellerimiz GR'nin alternatif arayüzlerle MR ile oligomerize olabileceğini ve ligand veya antagonist bağlanmanın arayüz tercihini etkileyebileceğini gösterdi. Ayrıca, p53 mutantlarında CRY silinmesinin UV hasarına apoptotik ve anti-tümörijenik tepkileri transkriptom düzeyinde nasıl arttırdığını gösterdik.