Medicago truncatula'da nodülasyonda simbiyozoma salgılanan proteinlerin mekanizmasının anlaşılması

Medicago truncatula, yaygın olarak varil yoncası olarak bilinen, Akdeniz bölgesine özgü yıllık bir baklagil türüdür ve baklagil araştırmaları için yaygın olarak model organizma olarak kullanılır. Bu tür, nodül adı verilen özel bir kök organında azot bağlayan Sinorhizobium meliloti ile simbiyotik etkileşimler kurar. Nodüllerin içinde, rizobiyalar konak hücreler tarafından endositozlanır ve simbiyozomlar içinde hapsolur. Bu bölmede bakteriler azot bağlayıcı formlarına farklılaşır ve konağa amonyak sağlar. Bu gelişimsel geçiş, bakterilerin hayatta kalmasını ve farklılaşmasını düzenleyen konak proteinlerinin simbiyozom içine salgılanmasını gerektirir. Bu projede, simbiyozom tarafından salgılanan konak proteinlerini tanımlamayı ve bunların M. truncatula'da azot bağlanmasına etkilerini değerlendirmeyi amaçladık. İlk aşamada, Nodule Cysteine Rich (NCR) peptidleri olarak adlandırılan geç nodulinler ve bunların bakteriyel genomla bağlandıklarında etkileri keşfedilmiştir. Bunun için simbiyozomlar Percoll yoğunluk gradient santrifüjleme ile saflaştırılmış ve ardından DNA bağlayıcı proteinler izole edilmiştir. Proteomik karakterizasyon, Kütle Spektrometresi için Orbitrap platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu analizden, rizobiyal genomuna doğrudan bağlanan ve rizobiyal farklılaşmayı etkileyen üç nodül sistein bakımından zengin (NCR) peptid tespit edildi: NCRAL7, MtNCR418 ve MtNCRM81. Bunlar doğrudan simbiyozoma salgılanmakta veya Endoplazmik Retikulum'da bulunmaktadır. Bakteriyel DNA ile etkileşimleri muhtemelen transkripsiyonu değiştirir ve serbest farklılaşmaya katkıda bulunur. Ancak, bu peptitlerin hedef aldığı kesin DNA bölgeleri henüz belirlenmemiştir ve transkripsiyon baskılanması veya aktivasyonu üzerindeki doğrudan etkileri henüz tam olarak çözülmemiştir. Paralel bir dizi deneyde, erken nodulinlere odaklanılmıştır. Bunlar arasında, simbiyozom membranıyla birleşmesini sağlayan öngörülen glikosilfosfatidilinositol (GPI) ankrajı nedeniyle ENOD16 özellikle ilgi çekiciydi. Analiz için, fenotipleme ve kurtarma deneylerinde kullanılan proteinle ilgili Tnt1 insersiyon mutantları bu mutantlar üzerinde çalıştırılmıştır. Ekspresyon analizi, MtENOD16'nın özellikle nodüllere lokalize olduğunu ve gelişim bölgeleri arasında belirgin bir uzamsal dağılım gösterdiğini ortaya koymuştur. Fonksiyon kaybı deneyleri, ENOD16'nın bulunmadığı nodüllerin içinde hücre içi rizobiyaların kalıcı olamadığını ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, MtENOD16'nın etkili nodül fonksiyonu ve azot fiksasyonu için gerekli olduğunu göstermektedir. Yine de, MtENOD16'nın simbiyozomlar içinde rizobiyaları stabilize ettiği kesin moleküler mekanizma hala belirsizdir. Sonuçlarımız, konak-simbiyont etkileşiminin iki kritik yönünü vurgulamaktadır: (i) NCRAL7, NCR418 ve NCRM81 gibi DNA bağlayıcı NCR peptitleri, rizobiyal transkriptomu doğrudan yeniden programlayabilir ve (ii) ENOD16, nodül gelişimi sırasında hücre içi rizobiyal hayatta kalması için gereklidir. Bu sonuçlar simbiyozomlar içindeki moleküler diyalog hakkında yeni bilgiler sağlasa da, kesin düzenleyici yolakları tanımlamak için ek mekanizma çalışılması gerekecektir. Çalışmamız, simbiyotik azot vi fiksasyonunu daha iyi anlamak ve potansiyel olarak optimize etmek için konakçı faktörleri tanımlamanın ve karakterize etmenin önemini vurgulamaktadır.