Akt translokasyonu, fosforilasyonu ve aktivasyonunda pleckstrin homoloji (PH) etki alanının kendine ait mekanizmasını anlamak

Protein kinaz B (PKB, aynı zamanda Akt olarak da adlandırılır), hücre proliferasyonu, hayatta kalma, metabolizma, anjiyogenez ve apoptozda tartışmasız çok önemli bir oyuncudur. Akt, Ras-PI3K-Akt-mTOR sinyal yolunda önemli bir rol oynar. Plazma zarına Akt alımı, sinyal membran lipidi, PIP3 veya PIP2 ile etkileşime giren Pleckstrin homoloji (PH) alanı tarafından sağlanır. PH alanı ve PIP3 arasındaki etkileşim, sırasıyla PDK1 ve mTORC2 kompleksi tarafından kinaz alanındaki Thr308'in ve C-terminal düzenleyici alanındaki Ser473'ün fosforilasyonunu kolaylaştıran konformasyonel değişikliklerle sonuçlanır. Muazzam Akt aktivasyon mekanizmaları, çeşitli çalışmalar tarafından önerilmiştir; bunların tümü, Akt'nin plazma zarına yer değiştirmesinde PH alanına özgü bir rol ile sonuçlanmış gibi görünmektedir ve önceki NMR çalışmaları tarafından belirlendiği gibi, meme kanserinde PH alanı ile Calmodulin'in (CaM) moleküller arası etkileşime girdiğini ima etmektedir. Bununla birlikte, CaM'nin atomik düzeyde PH alanı ile nasıl etkileşime girdiğinin kesin mekanizması belirsizliğini koruyor. Ayrıca, Akt oto-inhibisyon durumunda veya bir "PH-in" konformerinde, PH alanı, kinaz alanındaki bir fonksiyonel kalıntının fosforilasyonunu önlemek için kinaz alanı ile intramoleküler olarak etkileşime girer. PH-kinaz allosterik arayüzündeki birkaç amino asit, PH-kinaz bölgesi oto-inhibisyonunu korur ve PH-kinaz bölgesi arayüzündeki kritik amino asitlerin mutasyonları, arayüzü bozma eğilimine sahiptir ve bu da bir "PH-out" konformer durumu ile sonuçlanır. PH alanının, Akt aktivasyonu için kritik bir olay olan membran lipidleri ile etkileşime girmesi için Akt'nin bir "PH-out" konformeri gereklidir. Ayrıca, PH-kinaz bağlayıcısında Arg 144 ile elektrostatik etkileşim oluşturan C-terminal kuyruğunda Ser 473'ün fosforilasyonu, Akt'yi aktive eden PH alanında konformasyonel yeniden düzenlemelere yol açar. Bununla birlikte, tam uzunluktaki Akt oto-inhibisyon durumunun yapısı, PH ve kinaz domain oto-inhibisyonunu anlamak için henüz kristalleştirilmemiştir. Burada, bu tezin amacı iki yönlüdür: Akt'yi plazma zarına almak için CaM'nin PH alanı ile nasıl etkileşime girdiğini ve PH alanının atomdaki kinaz alanı ile intramoleküler olarak nasıl etkileşime girdiğini PH-kinaz alanı oto-inhibisyonunda çok önemli bir rol oynayan arayüzey kalıntılarına vurgu yaparak anlamak için modelleme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonlarını kullanmak. Tezin ilk bölümünde, CaM-PH alan kompleksleri modellenmiş ve tüm atomların MD simülasyonlarına tabi tutulmuştur. Simülasyon sonuçları, CaM-PH alan etkileşimlerinin termodinamik olarak kararlı olduğunu ve bir 𝛂-sarmal etkileşimi yerine bir 𝝱-sarmalını içerdiğini, her ikisinin de NMR verileriyle uyumlu olduğunu ve elektrostatik ve hidrofobik etkileşimlerin CaM-PH kompleksini sürdürmek için kritik olduğunu göstermektedir. PH alanı, CaM lobları ile etkileşime girer; bununla birlikte, çoklu modlar mümkündür ve IP4'ün dahil edilmesi, PIP3'ün kutup başı etkileşimini, plazma membranında salıverme mekanizmasını işaret ederek CaM-PH alan etkileşimini azaltır. Tezin ikinci bölümünde, PH ve kinaz alanları arasındaki molekül içi etkileşimi araştırmak ve PH-kinaz bozulmamış arayüzünü koruyan önemli arayüzey tortularını belirlemek için aktif olmayan durumda tam vi uzunluktaki Akt'yi (480 tortu) modelledik. Ayrıca, Asp 323, önemli bir arayüz tortusu, PH-kinaz allosterik arayüzü üzerindeki etkisini ayırt etmek için His'e mutasyona uğradı. Sonuçlar, mutasyonun, ATP'nin Akt'deki ATP bağlama cebinden önemli ölçüde yer değiştirmesine yol açtığını ve kinaz alanının daha açık bir konformasyon benimsemesine yol açtığını göstermektedir. Ek olarak, RMSD ve RMSF profilleri, D323H'nin konformasyonel değişikliklerde bir artışa yol açtığını gösterir ve mutasyonun ATP bağlanma bölgesinden yaklaşık 21Â uzaklıkta olmasına rağmen, Akt'taki bu iki fonksiyonel bölge arasında belki de bir allosterik iletişim olduğu sonucuna varabiliriz. Tam uzunlukta oto-inhibe edilmiş Akt durumunun modellenmiş yapıları, farmasötik kimyagerlere, bozulmamış bir PH-kinaz arayüzü gerektiren Akt allosterik inhibitörleri ve bu tür bozulmamış PH-kinaz arayüzü gerektirmeyen ancak hücresel aktiviteleri için bozulmamış kinaz alanı N- ve C-lobları arayüzü gerektirebilecek ATP-rekabetçi inhibitörleri geliştirmeleri için rehberlik edecek en iyi temsillerdir. Allosterik ve ATP-rekabetçi inhibitörlerin geliştirilmesi, tümör hücrelerinde sıklıkla aktive edildiğinden ve düzenlenmesini gerektirdiğinden Akt'yi hedeflemek için çok önemlidir. Tez sonuçlarının, CaM-PH alan kompleksini ve sırasıyla Akt'ta PH-kinaz alanı arayüzüne ve ATP bağlama cebine bağlanan allosterik ve ATP-rekabetçi inhibitörleri hedefleyecek inhibitörlerin geliştirilmesinde işlevsel etkileri vardır. Son olarak, bu sonuçlar, tümü PH-kinaz alanı oto-inhibisyonunun gevşemesinden kaynaklanmış gibi görünen Akt kinaz aktivasyon mekanizması hakkında halihazırda var olan bilgi zenginliğine katkıda bulunur.