2
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Lipopolisakkaritle oluşturulan nöroinflamasyon modelinde pro-inflamatuar sitokinlerin ve yolaklarının glia limitans üzerine etkileri
Nöroinflamasyon (Nİ) merkezi sinir sistemi (MSS)'ne özgü, herhangi bir hasara veya şiddetli uyarana maruziyet sonucu esas olarak mikroglia ve astrositlerin inflamasyon benzeri cevaplarıyla oluşan karmaşık hücresel ve hücreler arası ilişkileri içeren bir süreçtir. Nörodejeneratif (ND) hastalıklar, travmatik beyin hasarı, inme ve nöropatik ağrı gibi pek çok hastalığın etyopatogenezinde rol oynadığı düşünülmektedir. Nİ'de aktive olan mikroglialar ve astrositler pek çok potansiyel nörotoksik kemoatraktan molekülün ve sitokinlerin ifadelerini arttırırlar. Nöral dokunun en dış tabakası olan, astrosit son ayakları ile vasküler yapıları çevreleyen parenkimal bir bazal membrandan oluşan glia limitans (GL), küçük moleküller ve hücrelerin beyin parankimine doğru olan hareketlerinin denetlenmesinde modifiye bir kan-beyin bariyeri gibi rol alır. Diğer dokularda organ parenkimi ile onu çevreleyen adventia tabakası arasındaki ilişki çalışılmış ve nöral dokuda bu ilişkinin adventia'dan (beyin zarları ve GL) parenkime olan yönü incelenmiş olmasına karşın, kronik Nİ'da önemli olduğunu düşünülen parenkimden adventisya'ya doğru olan etkileri çalışılmamıştır. Bu tez çalışmasında, intraserebroventriküler (İSV) lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen Nİ fare modelinde -ND hastalıklardakine benzer ama farklı olarak- hiperakut dönemde (2. ve 4. saatlerde) pro-inflamatuar sitokinler (İnterlökin 1 beta - IL1β, İnterlökin 6 - IL6, Tümör nekrosis faktör alfa - TNFα) ve reseptörleri (tümör nekrosis faktör reseptörü 1, 2 - TNFR1, TNFR2, interlökin 1 reseptörü 1 - IL1R1), moleküler (Western blotlama) ve görüntüleme (immünohistokimyasal işaretlemeler, aşırımlı (transmission) ve immunogold elektron mikroskopi) yöntemleriyle ilk defa GL'nin hem perivasküler (GLp), hem de teknik zorluklar nedeniyle daha zor görüntülenebilen süperfisiyal (GLs) kısımlarında araştırılmıştır. İSV LPS ile indüklenen Nİ farede modelinde 2. ve 4. saatlerde astrositik son ayaklarda şişme, bu yapıların distal kutuplarına doğru enerji kullanımının artışını destekleyen sinsityal oluşum gösteren mitokondriyonlar aşırımlı elektron mikroskobu (TEM) ile görüntülenmiştir. Aktive olan astrositlerden salgılanacak olan sitokinleri içeren veziküller TEM, veziküllerin sitokin içeriği ise TEM immünogold tekniği ile izlenmiştir. İmmünohistokimya (İHK) görüntülemelerinde aynı saatlerde astrositik aktivasyona uygun olarak IL1β yüzeyel kortikal alanlarda daha çok bulunan yüzey bağlantılı astrositlerin hem GLs'de, hem de parankime doğru inen kısımlarında gözlenmiştir. GLp'de astrosit son ayaklarının perivasküler yerleşimlerine uygun olarak aktivite artışı saptanmıştır. TNFα hem GLs hem GLp'de noktasal, sitoplazmik ve yaygın olarak gözlenmiştir. IL6 ise hem inflamatuar hem nöroprotektif özelliklerinden ve muhtemelen diğer 2 sitokine göre biraz daha geç ve az ifade edilmesinden dolayı GL'de belirgin bir paternde görüntülenememiştir. IL1R1, IL1β dağılımına benzer şekilde hem GLs hem de GLp'de izlenmiştir. Nİ'nun 4. saatinde, farelerin GL'sini içeren yüzeyel kortekslerinde Western blotlama ile IL6 ve IL1β'nın anlamlı olarak arttığı saptanmıştır. Bu bulgular, İSV LPS ile indüklenen Nİ'nin erken döneminde astrositlerde ve GL'de inflamatuar değişikliklerin ortaya çıktığını ve ND hastalık süreçlerinde astrositlerin de önemli olduğunu düşündürmektedir.
Molecular motor contractile mechanism of retinal pericytes
Although it is known that capillary pericytes function in the regulation of capillary tone and blood flow, the contractile proteins involved in these processes are unidentified. It is likely that α-SMA functions as a part of contractile apparatus in pericytes as it does in smooth muscle cells. Therefore, we examined the expression of α-SMA along the mouse retinal microvascular network together with the expression of Myh11 protein, which we identified as the potential myosin heavy chain isoform candidate based on the single cell transcriptomic data in the literature. We found that α-SMA is expressed by capillary pericytes, but depolymerization must be prevented for its demonstration in downstream segments, in contrast to Myh11, which highly colocalizes with α-SMA but is present throughout the microvascular tree. Immunofluorescent signals delineated close association of α-SMA and Myh11, which was also confirmed by high FRET efficiency, oriented as thin strands reminiscent of stress-fibers, conforming to a contractile function. The functional correspondence of this spatial association was evaluated by inhibition of actomyosin cross-bridge cycling with blebbistatin, which prevented noradrenaline-induced vasoconstriction. Alongside, a supportive mechanism in cellular contraction, actin polymerization, was assessed using markers identifying filamentous and globular forms of actin. After intravitreal noradrenaline application, actin polymerization was pronounced in downstream capillary pericytes, suggesting a need for actin polymerization for contractile force generation because they express α-SMA in low quantities. In conclusion, pericytes contract using actomyosin cross-bridge cycling, which is supplemented by actin polymerization in downstream pericytes.