3
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Arşivlenen Tez
Amiloidojenik yolak ile ilişkili genlerdeki kodlayan bölgedeki tek nükleotid polimorfizmlerinin ın silico analizi
Alzheimer hastalığı (AH), beyinde amiloid beta (Aβ) peptidinin ve hiperfosforile tau proteinin birikimiyle karakterize edilen, ilerleyici sinaptik disfonksiyon ve nöronal kayıpla seyreden nörodejeneratif bir hastalıktır. Aβ üretimi, amiloid prekürsör proteini (APP)'nin β-sekretaz (BACE1) ve γ-sekretaz kompleksi (PSEN1, PSEN2, PSENEN, APH1, NCSTN) tarafından proteolitik olarak işlenmesiyle gerçekleşmekte ve bu süreç amiloidojenik yolak olarak tanımlanmaktadır. APP, BACE1 ve γ-sekretaz kompleksi genlerinde yer alan bazı kodlayıcı varyantların, özellikle erken başlangıçlı formlar başta olmak üzere AH'nin genetik altyapısında kritik rol oynadığı birçok çalışmada gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında, amiloidojenik yolakta yer alan APP, BACE1, PSEN1, PSEN2, PSENEN, APH1A, APH1B ve NCSTN genlerine ait kodlayan bölgedeki yanlış anlamlı tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) olası moleküler etkileri, Phyre 2, SWISS-MODEL, Robetta, SIFT, PolyPhen-2, PANTHER, SNPs&GO, Meta SNP, PredictSNP1, PredictSNP2, PhD-SNPg, CADD, FATHMM-XF, MutPred2, DynaMut2, mCSM-Membrane, INPS-MD, ConSurf, HOPE ve Missense3D in silico araçlarıyla sistematik olarak incelenmiştir. Bu çok yönlü analizler ile varyantların; proteinlerin yapısal bütünlüğü, fonksiyonel özellikleri ve evrimsel korunmuşluk düzeyleri üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Çalışma sonucunda, APP'de G120D, C158Y, P173H, C291F, C316R, G323R, G323V, G325V, G326V, C337R, R527G, L548P ve G709S; BACE1'de Y75C, Y75H, G135D, G178R, G238A, G238R, G239V, Y259D, C330R, L346P, Y366H ve R412P; PSEN1'de G78R, I140N, L153P, Y154C, L174R, F205S, L226R, K239E, L268R, L286P, L381H, F388S, L424R ve F447S; PSEN2'de G84E, Y160C, Y294D ve Y294H; PSENEN'de G22E ve L26P; APH1A'da G122V, G122D, G126D, G126S ve A161D; APH1B'de L72P, L116R, A160P, T163K ve L169R; NCSTN'de ise R52H, L282P, G294E ve G332R değişimlerinin, analiz edilen tüm in silico araçlarda tutarlı biçimde zararlı veya patojenik etki gösterebileceği tahmin edilmiştir. Elde edilen veriler, gelecekte yapılacak deneysel doğrulama çalışmalarına yol gösterici nitelikte olup, patogenez mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkı sağlayacaktır.
TREM2 geninin transkripsiyonel kontrolünde amiloid beta 1-42'nin rolü
Demansın en yaygın sebebi olan Alzheimer hastalığı (AH) patolojisinde Aβ1-42 peptidi oldukça önemli bir yere sahiptir. Hastalığın patolojisinde hücre dışı alanda birikim yaptığı bilinen Aβ1-42'nin başka hücresel fonksiyonları da bulunmaktadır. Aβ'nın nükleusta lokalize olduğu ve gen regülasyonunu DNA'ya bağlanarak transkripsiyon faktörüne benzer biçimde düzenleyebildiği gösterilmiştir. AH'nın ilerlemesi ile birlikte oluşan nöroinflamatuvar yanıtta myeloid hücreler 2 üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptör (TREM2) kritik bir role sahiptir. TREM2 aktivasyonu aracılığı ile mikroglialar fenotiplerini değiştirebilmekte ve fagositozla ilişkili yolaklar aktive edilmektedir. Bu sebeple TREM2 sinyalleşmesindeki değişiklikler direkt biçimde mikroglial yanıtı etkilemektedir. AH patolojisi ile yakından ilişkilendirilen APOE ve Aβ, TREM2'nin ligandlarındandır. Grubumuz tarafından önceden yapılan çalışmada Aβ1-42 uygulaması sonucunda TREM2 ekspresyonunun düştüğü gösterilmiştir. Tez kapsamında yaptığımız çalışmada Aβ1-42'nin TREM2 geninin transkripsiyonel regülasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu hedefe yönelik biçimde, HEK293T hücrelerine 0.1 μM Aβ1-42 ve 1 μM Aβ1-42 uygulandı ve 24 saat sonrasında kromatin immünopresipitasyon ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (ChIP-qPCR) tekniği gerçekleştirilerek TREM2 geninin düzenleyici bölgelerinde Aβ'nın olası bağlanma bölgeleri sorgulandı. Kat artışı tekniği kullanılarak bu bölgelere ilişkin bağlanma sinyalleri hesaplandı. Elde edilen sonuçlara göre hedeflenen 4 bölgede de bağlanma sinyali gözlemlendi. Ayrıca 1 μM Aβ1-42 uygulama grubunda genin promotörünün flanker bölgesini içeren hedefte kontrole ve 0.1 μM Aβ1-42 uygulamasına kıyasla anlamlı seviyede bağlanma sinyalinin arttığı sonucuna ulaştık. Elde ettiğimiz veriler ile literatüre girmemiş yeni bir mekanizmayı, Aβ'nın TREM2 geninin düzenleyici DNA bölgeleriyle etkileşime girerek ekspresyonunu etkileyebileceğini öne sürmekteyiz. Aβ transkripsiyon faktörü benzeri işlevi aracılığıyla TREM2 ekspresyonunu değiştirerek AH'de nöroinflamatuvar cevabın ve fagositik temizlenmenin etkinliğini düşürüyor olabilir. Aβ ve TREM2 arasında tanımlanan yeni mekanizmaya dair daha ileri çalışmaların gerçekleştirilmesi AH'nin patolojisindeki hücresel süreçlerin daha iyi biçimde anlamlandırılmasını sağlayacaktır.
Penisilin-streptomisin antibiyotiklerinin mitokondriyal DNA kopya sayısı üzerindeki etkilerinin incelenmesi
Antibiyotikler, bakteriler ve funguslar gibi mikroorganizmalarda milyonlarca yıl içerisinde bir savunma mekanizması şeklinde evrimleşmiş kimyasal moleküllerdir. Bu moleküller, yapıları ve işlevlerinin keşfedilmesiyle klinik alanlarda kullanılmaya başlanmıştır. Her ne kadar antibiyotikler, temelde prokaryotik hücreli organizmaları etkilese de ökaryotik hücrelerde de birtakım etkilere sahip oldukları rapor edilmiştir. Klinik alanlarda sıkça kullanılan Penisilin-Streptomisin (PenStrep) antibiyotiğinin, ökaryotik hücrelerdeki etkileri halen tam olarak aydınlatılmamıştır. Ekibimizin daha önce Alzheimer hastalığında (AH) patolojik rol oynayan vitamin D reseptörleri üzerinde yaptığı bir çalışmada, PenStrep antibiyotiğinin doza bağlı olarak primer kortikal nöron kültüründe amiloid beta 1-42'nin (Aβ1-42) lokalizasyonunu sitoplazmadan nükleusa değiştirdiği gösterilmiştir. Bu durum, PenStrep uygulamasının bir şekilde Aβ1−42'nin nükleusa göç etmesini sağlayarak bir dizi hücre ve organel düzeyinde transkripsiyonel değişiklikler yapabileceğini düşünmemize neden olmuştur. Aβ1−42'nin aynı zamanda endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi organeller içerisinde de bulunmasını göz önünde bulundurduğumuzda, PenStrep antibiyotiklerinin dolaylı yoldan mitokondri ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısı üzerine etkisi olabileceğini düşündük. Çalışma kapsamında, HEK293T hücrelerinde üç farklı dozda PenStrep antibiyotik uygulamasının mtDNA kopya sayıları üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Sonuç olarak, 24 saat süreyle 5 ve 15 IU ve 48 saat süreyle 10 IU PenStrep uygulaması yapılan gruplarda mtDNA kopya sayısının kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığı görülmüştür. Düşük doz antibiyotik uygulaması ile görülen mtDNA kopya sayısındaki bu artış, oksidatif fosforilasyon sisteminin aktivitesini sürdürmeyi amaçlayan bir telafi mekanizması olabilir. Yüksek dozda görülen durum ise yüksek oksidatif stres karşısında hücrenin daha fazla mitokondri üretmesi ile bağlantılı olabilir. 48 saat 10 IU PenStrep uygulamasında görülen artışın ise hücrede bu dozda oluşan oksidatif stresin ancak kendisini bu sürede göstermesiyle açıklanabilir. Antibiyotik uygulaması ile mtDNA kopya sayısının artmasının hücresel ve moleküler mekanizmalarla ilişkisinin kurulması için daha ayrıntılı ve kapsamlı çalışmalar yapılması gerekmektedir. PenStrep antibiyotiğinin mitokondri üzerindeki fizyolojik etkilerini anlamak, antibiyotiklerin patolojik mekanizmalara katılımını anlamak için önemlidir. Anahtar kelimeler: penisilin, streptomisin, antibiyotik, mitokondri, DNA