Theses supervised by Prof. Dr. Necdet Demir
11 theses · Akdeniz University
Stz-indüklenmiş diyabetik fare ovaryumunda endoplazmik retikulum stresi (ERS) ilişkili protein ekspresyonlarının değerlendirilmesi
Hücre organellerinden biri olan endoplazmik retikulumun (ER) başlıca görevi; yeni oluşan sekretuvar ve membran proteinlerin olgunlaşmasını ve tersiyer yapılarda doğru katlanmalarını sağlamaktır. N-bağımlı glikozilasyon inhibisyonu, kalsiyum dengesinin bozulması, hipoksi, oksidatif stres, glukoz yoksunluğu, viral enfeksiyonlar ve ortamın sıcaklığı gibi çevresel koşullar, yanlış katlanmış ya da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesine yol açarak ER stresi (ERS) adı verilen olayı meydana getirir. ERS'ye cevap olarak hücrede dengeyi yeniden sağlamak için katlanmamış protein cevabı (Unfolded Protein Response, UPR) adı verilen sinyal yolağı aktif hale gelir. UPR veya ERS cevabının çeşitli fizyolojik durumlara karşı etkili bir adaptasyon mekanizması olduğu bilinmekle birlikte diabetes mellitus gibi hastalıkların fizyopatolojisi ile ilişkisi olduğu bildirilmiştir. Diyabetle indüklenmiş hiperglisemi ya da glukoz emilimindeki yetersizliğin fare granuloza hücrelerinin apoptozuna yol açtığı ve oositlerde; mayozun ilerlemesini azalttığı, düşük oosit kalitesine neden olduğu bilinmektedir. Hiperglisemik koşulların fare ovaryumlarında yarattığı olumsuz sonuçların nedenleri arasında, bozulan protein sentez mekanizması, ERS'nin ve buna cevap olarak ortaya çıkan hücre kaderini belirleyen UPR mekanizmasının rolleri olabilir. Çalışmamızda, 24 günlük toplam 31 adet BalbC ırkı dişi fare kullanılarak üç grup oluşturuldu: 1) kontrol grubu (herhangi bir uygulama yapılmayan grup) (n=10), 2) çözgen grubu (intra peritonel (i.p) 100 µl sodyum sitrat enjekte edilen grup) (n=6), 3) diyabet grubu (n=15) (tek doz 90 mg/kg streptozotosinin (STZ) i.p. olarak enjekte edilen grup). Diyabet modelinin takibi için, STZ enjeksiyonu takiben 2. , 7. ve 14. günlerde kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 300 mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edildi. 14 günlük takip süresinin sonunda dişiler sakrifiye edilerek ovaryum örneklerinde ERS proteinlerinin (GRP78, DDIT3, KASPAZ 12 ve p-PERK) lokalizasyonları ve ekspresyon seviyelerini göstermek amacıyla immünohistokimya ve western blot yöntemleri uygulandı. qRT-PCR yöntemi ile ERS belirteçleri olan Grp78 ve Ddit3 genlerine ait mRNA ekspresyon seviyeleri incelendi. Diyabet grubuna ait ovaryum örneklerinde p-PERK ve DDIT3 proteinlerinin immün boyanmaları kontrol ve çözgen gruplarına kıyasla anlamlı olarak arttığı gözlendi. Her iki proteininde immün boyanmaları özellikle atretik foliküllerde, apoptotik granüloza hücrelerinde ve dejenere ovositlerde görüldü. Ovaryumlarda p-PERK, GRP78 ve Kaspaz 12 protein miktarı açısından gruplar arasında anlamlı farklılık olmadığı belirlendi. Grp78 mRNA düzeyi gruplar arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Ddit3'ün mRNA miktarı diyabetik gruplarda anlamlı olarak artarken protein düzeyinde gruplar arası herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. XBP1s protein miktarının ise diyabetik ovaryumlarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak; diyabetin fare ovaryumlarında ERS'yi başlatarak UPR'yi tetiklediği tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: ERS, Diyabet, UPR, Fare, Ovaryum.
Polikistik Over Sendromu (PCOS)'nda mTOR (The Mammalian Target of Rapamycin) Mekanizması
PCOS yaygınlığı, farklı tanı kriterlerine göre değişmekle beraber, genel olarak doğurganlık çağında % 5-10 civarında izlenen, üreme çağındaki kadınlarda en sık rastlanan reprodüktif endokrinopati olarak gösterilmiştir.mTOR (The mammalian target of rapamycin), hücre içerisinde hücrenin büyümesi, çoğalması, metabolizma ve anjiyogenez gibi pekçok işlemde görev almaktadır. Yapılan son çalışmalarla mTOR yolağı ovaryum folliküllerinde de incelenmiş, granuloza hücrelerinin çoğalması ve farklılaşmasında görev aldığı belirlenmiştir.Polikistik over sendromunda, foliküllerde yer alan granuloza hücreleri hızlı bir bölünme göstermektedir. Böylelikle foliküllerin ve dolayısıyla ovaryumun hacimsel bir artışı söz konusudur. PCOS olan hastaların overlerinde yüksek düzeyde granuloza ve teka hücresi proliferasyonu gerçekleşmektedir. Bu durum bize; mTOR sinyal yolağının, PCOS'da granuloza ve teka hücrelerinin yüksek düzeydeki proliferasyonundan sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmamızda, mTOR sinyal yolaklarından birinin ya da her ikisinin (TORC1 ve TORC2) PCOS mekanizmasında rol alabileceğini düşünmekteyiz. Buradan yola çıkarak, PCOS oluşturulan fare modelinde mTOR sinyal yolağının/yolaklarının etkili olup olmadığını belirlemeyi amaçlıyoruz.Çalışmamızda 25 günlük toplam 30 adet BalbC türü fare kullanılarak 3 grup oluşturuldu: İlk grup herhangi uygulamanın yapılmadığı kontrol grubu (K) (n=10), ikinci grup PCOS grubu (P) (n=10) (6 mg/100g DHEA'nun 0.1 ml susam yağı içerisinde çözülerek günlük subkutan olarak verildiği grup), Üçüncü grup yalnızca çözücünün verildiği (sadece susam yağı verilen) (Ç) (n=10) grup. Çalışmamızda gruplar arasındaki morfolojik farkı ortaya koymak amacıyla hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Çoğalan granuloza hücrelerini göstermek amacıyla mTOR ve P-mTOR (serine 2448) antikorları ile çiftli immünohistokimya yöntemi uygulandı. mTORC1, mTORC2 kompleksleri ile P70S6K, P-P70S6K ve PKCalpha, P-PKCalpha antikorları için western blot ve RT-PCR yöntemleri uygulandı. Gruplar arasındaki östradiol ve progesteron seviyelerini karşılaştırmak amacıyla da ELISA tekniği kullanıldı. Tüm sonuçların istatistiksel analizleri Sigma Stat 3.0. Student t-testi kullanılarak yapıldı.Çalışmamızda ilk defa PCOS fare modelinde mTORC1 ve mTORC2 kompleksleri ile bu komplekslerin ürünleri incelenmiştir. Sonuçlarımız PCOS fare modelinde mTORC1 ve mTORC2-aracılı sinyal yolaklarının aktivasyonunun PCOS'lu fare ovaryumunda önemli bir role sahip olabileceğini göstermektedir. Bu bulgular her iki kompleksin de (TORC1 ve TORC2) PCOS'da artan granuloza ve teka hücre proliferasyonundan sorumlu olabileceğini göstermektedir.Sonuç olarak mTORC1 ve mTORC2 sinyal yolaklarının denetlenmesi; PCOS'un önemli bir semptomunu oluşturan ovaryal kistlerin oluşumunun engellenerek; folikül büyümesi ve oosit gelişimindeki sorunların çözümlenmesine ve anovulasyona bağlı kısırlık sorununa yaklaşımda, yeni stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Characterization of EPABP [embryonic poly(a) binding protein] and pabpc1 [poly(A) binding protein, cytoplasmic 1] expression in testis
ePABP (embryonic poly(A) binding protein), functions in translational regulation of the maternal mRNAs stored during oocyte development. In the early embryos after embryonic genome activation and in the somatic cells, translational control of the mRNAs is carried out by PABPC1 (poly(A) binding protein, cytoplasmic 1). In mammalians, transcription ceases at midspermiogenesis stage of spermatogenesis. In this study, we aimed to characterize expressional levels and cellular localizations of the ePABP and PABPC1 mRNAs in the postnatal mouse testes and isolated spermatogenic cells. For this purpose, testes were obtained from C57BL/6male mice at different ages of postnatal development (D6, D8, D16, D20, D29, D32 and D88). ePABP and PABPC1 gene expression in the dissected testes and isolated spermatogenic cells were detected by qRT-PCR. Also, cellular localization of the ePABP mRNA by using RNA in situ hybridization was revealed in the postnatal mouse testes. As a result of this study, ePABP gene expression was found to be very low levels at D6, D8, D16 and D20 testes; it began to increase at D29 and reached the highest level at D32. While PABPC1 expression at D6 and D8 testes was observed at low levels, it started to increase at D16 and reached the highest level at D32. ePABP gene expression in the spermatogonia, spermatocytes and round spermatids derived from D32 testis was determined higher than other days. Similar to ePABP findings, PABPC1 expression in the spermatogonia, spermatocytes and round spermatids was higher than other days. It was found that ePABP mRNA was localized to only in the seminiferous tubules and exhibited cytoplasmic localizations in the spermatogenic cells of the seminiferous tubules. Also, ePABP mRNA was demonstrated to be higher particularly in the spermatogonia at D29, D32 and D88 testes. These results show that ePABP and PABPC1 genes may function in translational control of the mRNAs transcribed during mouse spermatogenesis.
Pereimplantif dönem fare embriyo gelişiminde p38 MAPK aracılı GLUT ekspresyonunun değerlendirilmesi
Fertilizasyon ile implantasyon arasında geçen yaklaşık bir haftalık süre preimplantasyon gelişim dönemi olarak tanımlanır. Bu dönemde meydana gelebilecek herhangi bir anormallik, embriyonun gelişim potansiyelini ve/veya yaşayabilirliğini etkileyebilmektedir. Glukoz preimplantasyon embriyolarda 8-hücreli embriyo aşamasından önce kullanılmazken, kompaksiyonun gerçekleşmesinden itibaren embriyo gelişimini destekleyen temel enerji kaynağıdır. Preimplantasyon embriyolarda glukoz transportu, ?kolaylaştırıcı glukoz taşıyıcıları? olarak bilinen GLUT proteinleri aracılığı ile gerçekleştirilir. GLUT proteinleri, preimplantasyon embriyoların değişen çevresel koşullara ve metabolik ihtiyaçlara adaptasyon yeteneğini sağlamaktadırlar. p38 MAPK (mitojenle-aktive edilen protein kinaz) sinyal yolağı çok sayıda önemli hücresel aktivitede rol oynamaktadır. Yapılan çalışmalarda, p38 MAPK sinyalinin farmakolojik inhibitörü olan Sitokin Baskılayıcı Anti-İnflamatuar İlaçlar (CSAIDs) kullanılarak p38 MAPK aktivitesinin inhibe edilmesinin, preimplantif gelişimi yavaşlattığı gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, p38 MAPK sinyali ile GLUT ekspresyonu arasında bir ilişki olduğu da farklı somatik hücre hatlarında ortaya konulmuştur. Bu bulgular, p38 MAPK yolağının preimplantasyon embriyolarda da glukoz metabolizması ile ilişkili bir mekanizma olabileceğini akla getirmektedir. Çalışmada 5-6 haftalık dişi farelerden (Balb/C) toplanan 2-hücreli embriyolardan kontrol, çözgen (inhibitör çözücüsünün verildiği) ve inhibitör (20 µM SB203580 verilen) olarak üç grup oluşturulmuştur. İn vitro kültür süresince embriyoların gelişim potansiyelleri takip edildi ve kontrol grubundaki yarıklanma süresi esas alınarak karşılaştırıldı. Bu üç gruptan in vitro ortamda elde edilen 8-hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolarda GLUT1 ve GLUT4 ekpresyon düzeyleri belirlendi. GLUT1 ve GLUT4 proteinlerinin kalitatif değerlendirmeleri immünfloresan yöntemiyle; bu genlerin mRNA ekspresyonları ise qRT-PCR (kantitatif real time PCR) yöntemi ile belirlendi. Çalışmamızın sonuçlarına göre, p38 MAPK sinyal aktivitesinin preimplantasyon gelişiminin devamı için gerekli mekanizmalardan biri olduğu görülmektedir. Hücre içerisindeki p38 MAPK sinyal aktivitesinin durdurulmasına bağlı olarak, GLUT1 protein ekspresyonu morula ve blastosist evresi embriyolarda; GLUT4 protein ekspresyonu blastosist evresi embriyolarda belirgin düzeyde azalmaktadır. Ayrıca, p38 MAPK inhibisyonunda blastosistlerde Glut1 ve Glut4 mRNA ekspresyon düzeyinde artış gözlenmiş, fakat bu artış anlamlı bulunmamıştır. Sonuç olarak, preimplantasyon dönem embriyolardaki p38 MAPK sinyali, GLUT1 ve GLUT4 protein ekspresyonlarının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çalışmamız, preimplantasyon gelişimi düzenleyen hücre içi mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Metastatik ve non metastatik tümörlerde nefronektin ekspresyonu
Meme kanseri kadınlarda sıkça görülen ve tedavi edilmezse ölüme sebebiyet verebilen bir kanser türüdür. Meme kanseri metastaz yapma yeteneği sebebiyle tehlikeli bir hastalıktır. Metastaz; tümörün bulunduğu yerden ayrılıp başka bir organda yeni bir tümör oluşturmasıdır. Metastazın gerçekleşebilmesi için tümör önce bulunduğu dokuda büyüyüp gelişmeli daha sonra da damarlar yardımıyla uzak organlara göç etmelidir. Tümör metastazı sırasında yeni gideceği çevredeki normal yapıyı bozarak kendine bir ortam yaratmalıdır. Bu yeniden düzenlenmede de hücre dışı matriks proteinleri de görevalmaktadır. Nefronektin; epiteliyal mezenkimal geçişte rol oynadığı bilinen bir hücre dışı matriks proteinidir. Tümör gelişiminde rol alabileceği düşünülen nefronektinin metastatik tümörler üzerindeki etkisini gösteren bir çalışma henüz yapılmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda metastatik ve metastatik olmayan hücre hatlarını kullanarak oluşturulan primer tümörlerde ve metastaz alanlarında nefronektin ekspresyonunu değerlendirmeyi amaçladık. Çalışmamızda metastatik olduğu bilinen 4TLM ve 4THM; ve metastatik karakterde olmayan 67NR hücre hatları enjekte edilen farelerden 12. ve 25. günlerde alınan pimer tümör, akciğer ve karaciğer dokuları, ışık mikroskobu ve western blot araştırmaları için hazırlandı. Elde edilen kesitlerde nefronektin ve Ki67 proteinleri için immünohistokimya metodu uygulanarak bu proteinlerin dokulardaki dağılımları belirlendi. Western blot tekniği kullanılarak da nefronektin ve Ki67 ekspresyon miktarları protein düzeyinde araştırıldı. Bulgularımıza göre; nefronektin ekspresyonunun primer tümör, akciğer ve karaciğerlerde, metastazın yoğunluğuna bağlı olarak azaldığı gözlendi. Ayrıca metastazın ileri evresi olan 25. günde, metastazın henüz gerçekleşmediği 12. güne göre nefronektin ekspresyonunda bir azalma olduğu görüldü. Proliferasyon belirteci olan Ki67'nin; metastatik hücre hatlarından alınan dokularda yoğun olarak lokalize olduğu; ayrıca metastatik olmayan hücre hattından alınan dokularda da yoğun olmasa da varlığı belirlendi. Çalışmamız; metastatik yetenekteki hücre hatlarından elde edilen primer tümör, akciğer ve karaciğer dokularında nefronektin ekspresyon değişimini gösteren literatürdeki ilk çalışmadır. Elde edilen bulgular; hücrelerin dokuya invaze olabilmeleri ve hücre dışı matriks düzenini değiştirerek metastaz yapabilmelerinde nefronektin proteininin bağlantı noktalarında ayrılmaları sebebiyle ekspresyonunun düştüğü ve hücre dışı matriksdeki yerleşiminin bozulduğu ihtimalini düşündürmektedir. Özellikle metastazın yoğun olduğu alanlarda ekspresyonunun düşmesi bu proteinin metastatik süreçte görevli olma ihtimalini akla getirmektedir.
Sebebi anlaşılamayan tekrarlayan gebelik kayıplarında endoplazmik retikulum stres proteinlerinin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi
Amaç: Tekrarlayan gebelik kayıpları (TGK) gebeliklerin%2-5'ini etkileyen sitogenetik anormalliklerdir. Endoplazmik retikulum (ER), hücredeki protein ve lipit üretiminden sorumlu olan normal hücresel fonksiyonların ve hücre sağkalımının sürdürülmesi için önemli bir organeldir. ER stresi (ERS), ER'de çeşitli koşullar altında yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesiyle oluşmaktadır. ERS proteinlerinin gebelik ve TGK sırasında desidua ve koryon villusta ekspresyon seviyeleri bilinmemektedir. ERS proteinlerinin açıklanamayan TGK (ATGK)'deki rolü hakkında literatür bilgisi yoktu. "ATGK'de, ERS proteinlerinin ekspresyon düzeylerinin normal gebeliklere göre koryonik villus ve desiduada farklı olduğu hipotezini oluşturduk. Sebebi anlaşılamayan TGK olan hasta desidua ve koryon villus örneklerinde, ERS proteinleri olan GRP78 ve CHOP'un protein düzeyinde lokalizasyonlarını ve ekspresyonlarını belirlemeyi ve normal gebelik durumu ile karşılaştırarak hastalığın etiyolojisi hakkında fikir sahibi olmayı amaçladık. Yöntem: Kontrol endometriyum (KE) (n = 6), isteğe bağlı sonlandırılmış gebelik (İSG) (n = 6) ve Açıklanamayan Tekrarlayan Gebelik Kaybı (ATGK) (n = 6) olarak üç grup oluşturuldu. Gebelik gruplarının desidua ve koryon alanları stereomikroskop altında ayrıldı. Doku takibinden sonra 5 mikronluk kesitler alındı. HE histolojik boyama ile morfoloji ve ayrıca GRP78 ve CHOP proteinlerinin immünohistokimyasal boyama yöntemleri ile lokalizasyonları değerlendirildi. Bulgular : CHOP ekspresyonu ATGK grubunun maternal bölümünde kontrole göre daha yüksekti. Stromal hücrelerde artan GRP78 ekspresyonu, sağlıklı bir hamilelikte ATGK grubunda gebe olmayan gruba göre daha yüksekti. ATGK'deki desidual hücrelerde de şiddetli CHOP nükleer boyanması gözlenmiştir. İSG ve ATGK hastalarının koryon örneklerinde sitotrophoblast ve syncytiotrophoblast hücrelerinde hem sitoplazmik hem de nükleer GRP78 ve CHOP boyaması gözlenmiştir. Tartışma: İmmunohistokimyasal değerlendirmemiz sonucunda gebeliğin, maternal ve fetal ekstambriyonik hücrelerde ERS'ne neden olduğu, ATGK hastalarında normal gebelik örneklerine göre ERS proteini GRP78'in yüksek bulunması daha şiddetli bir ERS'ne, CHOP ekspresyonunun normal gebelik grubundan daha yüksek şiddette olması ise artmış apoptoza ve patalojik migrasyona bağlı gebelik kayıplarının geliştirebileceğini akla getirmektedir. Anahtar kelimeler: ERS, Açıklanamayan Tekrarlayan Gebelik Kaybı, İnsan
Linagliptinin insülin ile kombine tedavisinin tip 1 diyabetik fare ovaryumundaki katlanmamış protein cevabına olan etkisinin değerlendirilmesi
Amaç: Hipoglisemi riskini artırmadan kan şekerini düşürücü etkileri ve yüksek antioksidan aktivitesi olan linagliptinin, insülin ile birlikte kullanımının tip 1 diyabetik fare ovaryumlarında endoplazmik retikulum (ER) stresi ilişkili yanıtta rol oynayan protein ve genlerin ekspresyon düzeylerini nasıl etkilediğini incelemeyi amaçladık. Yöntem: Çalışmamızda; 6 haftalık 84 adet Balb/C ırkı dişi fare kullanılarak her grupta 12 adet fare olacak şekilde yedi grup oluşturuldu: Kontrol grubu, Çözgen grubu, Diyabetes mellitus (DM)+İnsülin grubu, DM+Linagliptin grubu, DM+Linagliptin+İnsülin grubu, DM+TUDCA grubu, DM+TUDCA+İnsülin grubu. Deney süresince fare vücut ağırlıkları kaydedildi ve deney sonunda ovaryum ağırlığı indeksleri belirlendi. Sağlıklı folikül sayımı yapılarak ovaryal folikül rezervi belirlendi. Kan serum örneklerinde DPP-4 aktivitesi ölçümü ve ovaryum örneklerinde oksidatif stres belirteçlerinden MDA seviyesi ve NOX1 aktivitesi ELISA yöntemi ile ölçüldü. Ovaryum örneklerinde ATF6, ATF4, kaspaz 12, cleaved kaspaz 3, XBP1 ve JNK1/2 protein ifadeleri immunohistokimya ve western blot yöntemleriyle belirlendi. qRT-PCR yöntemiyle Grp78/BiP ve pro- apoptotik Chop/Ddit3 genlerinin seviyeleri belirlendi. Bulgular: Linagliptin ve insülinin birlikte kullanımı oksidatif stres seviyelerini azaltmada daha etkindi. En az atretik folikül sayısı DM+Linaglitin+İnsülin grubunda gözlendi. Linagliptin ve insülinin birlikte kullanımı sonrasında incelenen proteinlerin ifadelerinde azalma meydana geldi. Ayrıca Grp78/BiP gen düzeyinde gruplar arasında fark bulunmazken, DM+Linagliptin+İnsülin grubu Chop/Ddit3 mRNA seviyesini azaltmada ve pro-apoptotik süreci inhibe etmede daha başarılıydı. Sonuç: Çalışmamızda, linagliptin ve insülin kombinasyonunun tip 1 diyabetik fare ovaryumlarında ER stresi ilişkili apoptotik proteinlerin ve genlerin ekspresyon düzeylerini azaltmada etkin rol oynadığı görüldü. Çalışmamızın diyabete bağlı gelişen ovaryan başarısızlıkların tedavisinde kullanılabilecek yeni yaklaşımlara katkıda bulunacağına inanmaktayız. Anahtar Kelimeler: Diyabet, endoplazmik retikulum, stres, ovaryum, fare.
Fetal germ hücre gelişiminde hücreler arası köprülerin rolü
Amaç:Hücreler arası köprüler somatik hücrelerde hücre bölünmesinin sitokinez evresinde oluşan geçici yapılardır. Farede farklılaşan germ hücreleri arasında TEX14 proteininin varlığı ile kalıcı yapılara dönüşen hücreler arası köprülerin, diploid dişi germ hücrelerindeki rolü belirsizliğini korumaktadır. Çalışmamızda, germ hücrelerinde hücreler arası köprü içermeyen Tex14 mutant (Tex14-/-) fareler kullanılarak, hücreler arası köprülerin mayozun senkronizasyonu ve germ hücre havuzunun kurulmasındaki rolü üç boyutlu (3D) analiz yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Yöntem:Wholemount immünofloresan yöntemi ile Tex14+/+ ve Tex14-/- ovaryumlarda germ hücreleri mayoz ve apoptoz belirteçleri ile işaretlendi. Imaris programı ve MATLAB komut dizisi ile ovaryumların 3D haritası oluşturuldu. Ayrıca apoptozun grup/küme analizi gerçekleştirildi. Tex14+/+ ve Tex14-/- ovaryumlarda kimyasal stres oluşturulduktan sonra hücreler arası köprülerin varlığında ve yokluğunda hücre eliminasyonu değerlendirildi. Bulgular:Ovaryumda mayozun ilk olarak radyal bir dalga halinde başladığı, anterior-posterior (AP) mayotik dalganın ise E13.5'tan itibaren etkili olduğu izlendi. Tex14-/- ovaryumlarda, radyal mayotik dalganın olmadığı, sadece AP dalganın korunduğu ve Tex14-/- germ hücrelerinin Tex14+/+'e kıyasla mayoza daha erken başladığı dikkat çekti. Germ hücre eliminasyonunun gerçekleştiği dönemde Tex14-/- ovaryumlarda germ hücre sayısının azaldığı, apoptozun arttığı ve Tex14+/+'den farklı olarak, Tex14-/- germ hücrelerinin ovaryumda rastgele elimine edildiği izlendi. Stres indüklendiğinde ise germ hücre kaybının oransal olarak Tex14+/+'de Tex14-/-'e göre artmış olduğu tespit edildi. Sonuç:Çalışmamızda, ovaryumda hücreler arası köprülerin radyal mayotik dalganın düzenlenmesinde ve apoptoz düzeyinin belirlenmesindeki rolleri literatürde ilk defa ortaya konulmuştur. Fetal germ hücre gelişiminin araştırılması, ovaryan rezervin kurulmasında etkili olan mekanizmaları anlamamızı sağlayarak, infertilite, subfertilite ve oositlerde sıklıkla izlenen anöploidi ile ilgili bilinmeyenlere ışık tutacaktır.
Preeklemptik insan plasentasındaki 20q TERRA ekspresyon seviyelerinin değerlendirilmesi
Amaç: Telomerik tekrarların, kromozom bütünlüğünün korunmasında ve onarım mekanizmalarında görev aldığı bilinmektedir. TERRA transkriptleri ise telomerik bölgelerin korunmasında görevlidir. Preeklampside telomer boyunun kısaldığı yapılan bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Preeklampsideki bu telomer kısalmasının TERRA transkriptleri ile ilişkili olabileceğini düşündük ve "Preeklemptik insan plasentasında 20q TERRA ekspresyon seviyesi değişir" hipotezini kurduk. Bu doğrultuda preeklemptik insan plasentası ve sağlıklı insan plasentalarında 20q TERRA transkripsiyon seviyelerini inceledik. Yöntem: Preeklemptik insan plasentası (n=6) ve sağlıklı insan plasentası -kontrol- (n=6) olacak şekilde iki grup oluşturuldu. Örnekler, serum fizyolojik ile yıkandı. Her bir örnekten cDNA elde edilerek 20q TERRA transkriptlerinin seviyeleri kantitatif gerçek zamanlı polimarez zincir reaksiyonu (qRT-PCR) deneyi ile analiz edildi. Elde edilen veriler, GraphPad ile değerlendirildi. Aytıca her örnekten alınan doku örnekleri için rutin parafin takibi yapıldı. Mikrotom ile 5 μm kalınlığında kesitler alınarak hematoksilen&eozin boyaması yapıldı ve fotoğraflandı. Bulgular: Preeklampsi grubunda 20q TERRA ekspresyon seviyesi, mRNA düzeyinde kontrol plasentaya göre artış gösterdi. Histolojik gözlemlerde preeklemptik insan plasentasındaki trofoblastik tomurcuklar yoğun olarak gözlemlenmiştir. Sonuç: Preeklampsi grubunda TERRA ekspresyon seviyesi, kontrol grubuna göre artmıştır. Bu sonuçlar, preeklampside görülen telomer kısalmasının TERRA transkripsiyon seviyesinin artması sonucu olabileceğini göstermektedir.
Retinal dejenerasyon oluşturulmuş fare modelinde neuregulin-1'in endoplazmik retikulum stresi üzerindeki etkisi
Giriş: Neuregulin-1 (NRG-1), Endoplazmik Retikulum stresini (ERS) azaltan bir ajandır. Tedavi yaklaşımları oldukça kısıtlı olan retinal hastalıkların oluşumunun sebepleri arasında ERS gösterilmektedir. Projemizde retina dejenerasyonunun nedenlerinden biri olarak gösterilen ER stresini NRG-1 ile baskılamayı ve bunun retinal dejenerasyon patogenezi üzerindeki etkisini morfolojik ve immünohistokimyasal çalışmalar ile değerlendirmeyi amaçladık. Böylece ERS kaynaklı retinal hastalıklarda Neuregulin-1'in hem proflakside hem de tedavideki etkisi hakkında fikir sahibi olmayı hedefledik. Yöntem: Deney hayvanı olarak 6-8 haftalık BALB/c ırkı erkek fareler kullanıldı. Retinal dejenerasyon modeli için, farelere 60 mg/kg vücut ağırlığı dozunda N-methil- N–nitröz (MNU) intraperitoneal (IP) tek doz enjeksiyon yapıldı. MNU kullanımdan hemen önce steril serum fizyolojik içerisinde seyreltilerek farelere enjekte edildi. Tedavi grubu için; farelere 0.6 mg/kg/gün dozunda Neuregulin-1 intraperitonel (IP) enjeksiyon yapıldı. MNU enjeksiyonu yapıldığı gün 0. gün olarak kabul edildi ve tedavi, her gün tek doz Neuregulin verilerek 3. ve 7. günlerde retina diseksiyonu yapıldı. Hematoksilen-eosin ile boyanan örnekler ışık mikroskobunda incelendi, İmmunoflorosan yöntemi kullanılarak gruplara ait retina örneklerinde GRP78, CHOP, Cleaved Caspase 3 protein ekspresyonları incelendi. Hücre ölümü belirteci olarak TUNEL yöntemi kullanıldı. Bulgular: MNU ile indüklenmiş retina dejenerasyonu oluşturulmuş fare modellerinde, NRG-1 tedavisiyle ERS proteinlerinde (GRP78-CHOP-Cleaved Caspase 3) azalma gözlemlenmiştir. TUNEL sonuçlarına göre NRG-1 tedavisi uygulanan deneklerde TUNEL-pozitif hücre sayısında düşüş olduğu belirlenmiştir. Sonuç: MNU ile indüklenmiş retina dejenerasyonunda retina hücrelerinde ERS'nin hafiflediği ve hücre sağ kalımının arttığı gözlemlenmiştir.
Investigation of the expression levels of tam receptor kinases and ligands in unexplained recurrent pregnancy loss
Objective: The role of immunological, genetic and hematological factors in RPL is known. The etiology of unexplained RPL (URPL), which accounts for 50% of RPL, is unknown. Immunological balance is important in the continuity of pregnancy. Inflammation and phagocytosis are regulated via TAM receptor kinase (TYRO3, AXL, MERTK) and ligands (GAS6 and PROS1). Since we think that TAM receptors and ligands may be effective in URPL, We hypothesized that "the expression levels of TAM receptor kinases and ligands in URPL differ from normal pregnancies in chorionic villus and decidua". We aimed to approach the etiology of URPL by comparing mRNA and protein expressions of TAM receptor kinases and ligands in samples of URPL, voluntary terminated pregnancy (TP) who didn't have spontaneous pregnancy loss and endometrium (KE) groups. Method: The groups were formed as (1) URPL (n: 5), (2) TP (n: 6) and (3) KE groups (n: 6). In groups 1 and 2, decidua and chorionic villus materials were separated under a steriomicroscope. The AXL, MERTK, TYRO3, GAS6 and PROS 1 levels of the samples were analyzed by immunohistochemistry, immunoblot and QPCR methods. Results: In healthy pregnancy, increase in TAM receptors, decrease in GAS6 ligand, no significant change in PROS1 was detected. Expression of receptors and ligands in URPL were increased. Conclusion: In TP and URPL, TAM receptors and ligands had differences in expression in decidua and chorionic villus. We believe that these receptors limit ligands in gestation and inhibit excessive phagocytotic activity and modulate immunological cells, contributing to the prevention of rejection of the semiallogenic fetus. Increased receptor and ligand in URPL increased phagocytic activity due to death and inhibited inflammation, thus preventing maternal tissue damage. Key words: Unexplained Recurrent Pregnancy Loss, AXL, MERTK, TYRO3, GAS6, PROS1