Hepatocyte nükleer faktörü 1-α transkripsiyon faktörünün nükleer lokalizasyon sinyalinin araştırılması

MODY (Maturity onset of diabetes of youth) diyabetin tek gene bağlı bir alt grubu olup en sık görülen tipi MODY3'tür. MODY3 hastalarında pankreas, böbrek ve karaciğerde görevli transkripsiyon faktörü olan HNF1A geninde mutasyonlar tespit edilmiştir. Bu mutasyonlar proteinin DNA'ya bağlanmasını, transaktivasyon fonksiyonunu ya da hücre çekirdeğine lokalize olmasını etkilemektedirler. Önceki çalışmalarda mutant R271W ve S345Y HNF1A proteinlerinin hücre çekirdeğine lokalize olmalarının hasarlı olduğu tespit edilmiştir. Ancak bu hasarın moleküler mekanizması henüz aydınlatılmamıştır. İmportin α taşıma reseptör ailesi transkripsiyon faktörü gibi hücre çekirdeğinde görevli proteinlerin hücre çekirdeğine taşınmasından sorumludur. Bu proteinler kargo proteinlerine kargo proteinler üzerinde bulunan NLS (Nuclear localization signal) motifleri üzerinden bağlanmaktadır. Klasik NLS motifleri bazik amino asitler içermesine rağmen, klasik olmayan NLS motiflerinin de bulunduğu gösterilmiştir. İmportin α, amino asit ve fonksiyonel benzerlik olarak 3 alt gruba ayrılmaktadır. Şu ana kadar HNF1A proteini üzerinde belli bir import sinyal motifi rapor edilmemiş olsa da HNF1A proteini ile yapılan çalışmalarda klasik NLS bölgesi tanımına uyan 3 bölge (A, B ve C bölgeleri) olduğu gösterilmiştir. A bölgesi HNF1A proteininde 158-171 amino asitleri arası, B bölgesi 197-205 amino asitler arası ve C bölgesi 271-282 amino asitler arasında yer almaktadır. Ancak HNF1A'nın taşınmasından sorumlu importin α alt grubu ve diğer klasik olmayan NLS bölgeleri henüz rapor edilmemiştir. Yürütülen bu projenin ilk amacı, HNF1A transkripsiyon faktörünün hücre çekirdeğine taşınmasından sorumlu importin α alt grubunun tespit edilmesidir. Bu amaçla importin α proteinin 3 farklı alt grubu fare homolog karyopherin α proteinlerinden (Kpna2, 4 ve 6) seçilmiş ve seçilen proteinlerle HNF1A arasındaki etkileşim ko-immunoçöktüme yöntemiyle araştırılmıştır. Bu çalışma ile yabanıl HNF1A proteinin her 3 taşıyıcı protein ile de etkileşim halinde olduğu görülmüştür. En güçlü bağlanmayı Kpna6 proteini ile gösterdiğinden, projenin sonraki aşamalarında Kpna6 proteini ile devam edilmiştir. Bu etkileşimi doğrulamak için fare pankreas hücrelerinde (Min6) tespit edilen Kpna6 proteini siRNA kullanılarak susturulma çalışması yapılmış ve immunositokimyasal boyama çalışmasıyla HNF1A proteinin hücre içindeki lokalizasyonu araştırılmıştır. Kpna6 proteinin susturulması ile HNF1A'nın hücre çekirdeğine %10 daha az lokalize olduğu tespit edilmiştir. Projenin ikinci amacı ise MODY hastalarında tespit edilen ve hücre çekirdeğine lokalizasyonu hasarlı mutant HNF1A proteinleri (R271W ve S345Y) ve importin α alt grubu arasındaki etkileşimin araştırılmasıdır. R271W mutasyonu klasik NLS motifleri içerisinde olup, tespit edilen importin α alt grubunun HNF1A'yı tanıyıp bağlanma bölgesinde yer almaktadır. Bu sebeple R271W mutant HNF1Ave Kpna6 taşıyıcı protein arasındaki etkileşim ko-immunoçöktürme yöntemiyle araştırılmıştır. Yabanıl tip HNF1A ile karşılaştırıldığında R271W mutant HNF1A proteini ile Kpna6 proteini arasında daha az etkileşim olduğu görülmüştür. Bu sonuç R271W mutasyonunun proteinin klasik bir NLS motifi içerisinde yer aldığını doğrulamış oldu. S345Y mutant HNF1A proteini ise klasik bir NLS motifi içerisinde bulunmamasına rağmen, hücre çekirdeği lokalizasyonunda hasarlı olduğu tespit edilmiştir. Ko-immunoçöktürme çalışmalarında, bu mutant HNF1A proteinin, Kpna6 taşıyıcı protein ile etkileşiminde azalma gözlemlenmiş, bu da bu bölgenin klasik olmayan bir NLS bölgesi olduğunu desteklemektedir. Sonuç olarak yürütülen bu proje ile ilk defa HNF1A transkripsiyon faktörünün hücre çekirdeğine taşınma yolağında görevli taşıyıcı proteinler tespit edilmiş ve MODY3 hastalarında hastalığa sebep olan mutasyonların moleküler patogenezinin aydınlatılmasına katkı sağlamıştır. Ayrıca S345Y mutasyonun HNF1A proteinin üzerinde klasik olmayan NLS bölgesinde bulunduğu hipotezi de desteklenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, klasik olmayan NLS bölgeleri ile ilgili literatüre katkı sağlamış olacak ve daha detaylı projelerin hazırlanmasına önveri oluşturacaktır.