Denizkestanesi Paracentrotus lividus'un yumurta jel kılıfı glikoproteinlerinin izolasyonu ve glikan profilinin MALDI-TOF-MS ve LC-MS/MS sisteminde glikomik yaklaşımla belirlenmesi

Sperm ve yumurta interaksiyonunda yüzey karbonhidrat içerikleri büyük önem taşımaktadır. Denizkestanesi yumurtasını saran jel tabakada karbohidratça zengin glikoproteinler bulunmaktadır. Henüz çalışmamış olmakla birlikte bunların, omurgalı tanıma molekülleri ile homolog olduğu düşünülmektedir. Bu tabakada yer alan bazı glikoproteinler karakterize edilmiş olmasına karşın, glikan profilleri belirlenmemiştir. Bu nedenle bu tez çalışmasında; memeliler gibi alesital tip yumurtaya sahip olması nedeniyle model organizma olarak seçilen denizkestanesi Paracentrotus lividus'un yumurta jel kılıfında, fertilizasyonda önemi bilinen çeşitli glikoproteinlerin belirlenerek, glikan profillerinin glikomik yaklaşımla aydınlatılması amaçlanmıştır. Bunun için, asidik yöntemle izole edilen yumurta jel kılıflarına diyaliz ve liyofilizasyon yapılmış ve protein miktarı Bradford yöntemiyle ölçülmüştür. Jel kılıfın proteinleri SDS-PAGE ile, bunların hangilerinin glikozilli oldukları Periyodik asit-Schiff (PAS) boyama ile, glikozilli bu proteinlerden glikoprotein olanlarını belirlemek için ise, glikoproteinlerde uç şeker olan sialik aside spesifik LFA ile lektin blotlama yapılmıştır. Glikoproteinlerin glikan zincirlerini oluşturan monosakkaritlerin analizi için yumurta jel kılıfına asit hidrolizi yapılmıştır. Türevlendirme için sialik asit dışındaki monosakkaritlerde PMP reaktifi, sialik asitte DMB flouresan reaktifi kullanılmıştır. Örnekler CapLC-ESI-MS/MS sisteminde analiz edilmiştir. Glikanların glikomik yaklaşımla belirlenmesi için; N-glikanlar protein zincirinden PNGase F ile koparılmış, permetilasyon ile türevlendirilmiş, MALDI-TOF-MS ile N2 lazer eşliğinde analizleri yapılmıştır. Aynı örnekler, CapLC-ESI-MS/MS sisteminde parçalanma iyonları ile karakterize edilmiştir. O-glikan analizi için yumurta jel kılıfına amonyak çözeltisi doğrudan ilave edilmiştir. Ardından PMP ile türevlendirilmiş ve LC-MS/MS sisteminde analiz edilmiştir. Jel kılıf protein/glikoprotein profilinin karakterizasyonu sonucunda; SDS-PAGE ile ~250, 55, 50 ve 15 kDa civarında dört protein bandı ayırt edilmiştir. PAS boyama ile 250, 35 ve 10 kDa civarındaki proteinlerin glikozilli oldukları, bunlardan da sadece 250 kDa civarındaki büyük proteinin glikoprotein olduğu anlaşılmıştır. 35 ve 10 kDa civarındakiler olasılıkla proteoglikandır. Jel kılıf glikoproteinlerinde monosakkarit analizi sonucunda; sırasıyla en fazla fukoz olmak üzere mannoz, arabinoz+ksiloz, galaktoz, glukoz, N-asetilgalaktozamin ve N-asetilglukozamin bulunmuştur. Riboz, genetik materyalden kaynaklanmaktadır. Sialik asit tiplerinden en fazla Neu5Gc bulunmuştur. Ardından sırasıyla Neu5Ac, Neu9Ac5Gc, Neu5,9Ac2, Neu8Ac5Gc, Neu7Ac5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5,8Ac2 gelmektedir. Eser düzeyde de sülfat grubu taşıyan Neu5GcS ve Neu5AcS belirlenmiştir. Jel kılıf glikoproteinlerinde glikomik yaklaşımla yüksek mannoz N-glikan ve O-heksoz tipinde O-glikanlar bulunmuştur. Ayrıca çekirdek 1-8 yapıya benzer O-glikanlar da LC-MSn sisteminde belirlenmiştir. MALDI-TOF sisteminde de çekirdek 1-8 yapısı bulunabilmiştir. Sonuç olarak; bu çalışmada, yeni ve modern glikomik tekniklerden olan MALDI-TOF/MS, LC-ESI-MS/MS, lektin blotting sistemleri yanında bilgisayar programları da kullanılarak P.lividus yumurta jel kılıfı glikan profili ilk defa ortaya çıkarılmıştır. Çalışmada model organizma olarak kullanılan P.lividus'un evrim sürecinde diğer türlere göre değişmeksizin günümüze kadar yaşamını sürdürmesi, bu türün özel yapısını ortaya koymaktadır. Bu sayede sadece fertilizasyon değil, onun da ötesinde türleşmenin de moleküler açıklamalarına özellikle glikobiyolojik açıdan cevapların bulunabilmesi ilgi çekicidir. Model organizmada belirlenen detaylar anlaşıldıktan sonra diğer canlılarda da homolog moleküllere bakış açısı etkilenebilir. Bu bağlantıların iyi bilinmesi insanlarda infertilitenin araştırılmasına ve çözülmesine de katkı sağlayabilir