Format dehidrogenaz enziminin candida boidinii'den moleküler olarak klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

Modern biyoteknoloji endüstrisinde enzim üretimi önemli bir yer tutmaktadır. Klasik yöntemlerle bitkisel ve hayvansal kaynaklardan enzim eldesinin ekonomik olmaması, kalite ve miktar standardizasyonunun yakalanmasının zor olması gibi faktörler mikrobiyal kaynaklara olan eğilimi artırmıştır. Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesi ve mikroorganizmalarda kolaylıkla manipüle edilmesi ile birlikte rekombinant enzimlerin endüstriyel pazarının büyüyerek 2016 yılında 4.61 milyar dolara çıktığı açıklanmıştır ve 2017-2022 öngörü raporlarına göre %5.8'lik yıllık bileşik büyüme oranı ile 6.3 milyar dolara ulaşması beklenmektedir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (FDH, EC 1.2.1.2), format iyonlarını CO2'ye yükseltgeyerek NAD+ molekülünü NADH'a indirgeyen bir enzimdir. Enzimatik indirgemenin önemli olduğu reaksiyonlarda NAD(H) ve NADP(H) gibi pahalı kofaktörlere ihtiyaç vardır. Ekonomik alternatifler sunmak amacıyla kofaktörlerin geri dönüştürüldüğü metotlar dizayn edilmiştir. Bu metotlarda; kofaktör geri dönüşümünde hiçbir yan ürün biriktirmeyen, ana reaksiyonun substratına karşı inert olan böylelikle istenmeyen izomerler oluşturmayan, termodinamik denge olarak uygun olan, geniş pH aralığında çalışabilen, ucuz substratlara gereksinim duyan FDH enzimi sahip olduğu bu avantajlı özellikleri ile en çok tercih edilen enzimlerden biridir. Özellikle farmasötikler için önemli olan optikçe aktif bileşiklerin üretiminde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında tanılama testlerinde kullanımından dolayı FDH enziminin sentetik üretimi son yıllarda önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalar, çeşitli metilotrof maya ve bakterilerden FDH enziminin rekombinant olarak üretilebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada, Candida boidinii (C. boidinii) mayası ATCC 18810 suşunda FDH enzimini kodlayan gen bölgesinin rekombinant tekniklerle Escherichia coli (E. coli) bakterilerine klonlanması, gen ürünü olan proteinin eksprese edilmesi ve karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak C. boidinii mayasının genomik DNA'sı izole edilmiş, tasarlanan primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirilerek hedef FDH gen bölgesi çoğaltılmış ve beklenen 1104 bp'lik bant görülmüştür. Çoğaltılan gen TA klonlama metodu ile pTZR57R/T vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör pTZR57R/T+FDH ile E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücreleri transforme edilmiştir. Transformasyon gerçekleştikten sonra rekombinant vektör NdeI ve BamHI restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve hedef gen bölgesi ekspresyon vektörü olarak kullanılan pET-14b vektörü ile birleştirilerek E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyonun başarısı koloni PCR, restriksiyon enzim kesimi ve dizi analizleri ile onaylanmıştır. Sonrasında elde edilen rekombinant pET-14b/FDH vektörü ile ekspresyon hücresi olarak kullanılan E. coli One Shot® BL21 (DE3) hücrelerinin transformasyonu gerçekleştirilmiştir. FDH enziminin üretimi için gen ekspresyonu IPTG ile indüklenmiş, Ni-NTA afinite kolon kromatografisi ile hücredeki diğer proteinlerden ayrıştırılarak saf bir şekilde eldesi sağlanmıştır. Hedef proteinin varlığını görmek için SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapılmış ve beklenen 41 kDa'luk bant görülmüştür. Son olarak FDH enziminin ideal koşullardaki aktivitesini bulmak için testler yapılmış, enzimatik reaksiyon ürününün 340 nm'deki absorbans değerlerine bakılarak değerlendirme yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarının sonucunda; pH 8.0 Tris tampon çözeltisinde, 40 mM format substrat konsantrasyonunda, 60°C'a kadar olan sıcaklıklarda enzimin aktif olarak çalıştığı belirlenmiştir. Farmasötik endüstrisinde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bu enzim ülkemizde yurtdışı kaynaklardan temin edilmekte ve pahalıya mâl olmaktadır. Bu çalışma, NAD+-bağımlı FDH enziminin yerli olarak üretilmesi ve endüstriyel sahada büyük ölçekte üretime geçilmesi için veri sağlaması açısından önemlidir.