37
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
N-asetil sisteinin kolistin nefrotoksisitesine karşı koruyucu etkilerinin araştırılması
N-ASETİL SİSTEİNİN KOLİSTİN NEFROTOKSİSİTESİNE KARŞI KORUYUCU ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Amaç: Bu çalışmada kolistin nefrotoksisitesi oluşturulmuş sıçanlarda N-asetil sistein proflaksi ve tedavisinin böbrek fonksiyonları üzerine olan koruyucu etkisinin araştırılması amaçlandı. Yöntem: Erişkin Wistar erkek sıçanlar 4 gruba ayrıldı. Nefrotoksisite grubuna 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek intraperitonel (i.p.) yolla kolistin verildi. Tedavi grubuna 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek i.p. yolla N-asetil sistein (NAS) verildi. Yine bu gruba her bir NAS enjeksiyonundan 2 saat sonra 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde kolistin uygulandı. Diğer bir gruba ise 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek i.p. yolla NAS verildi. Kontrol grubuna aynı yolla 2 ml (mililitre)/kg (kilogram) serum fizyolojik uygulandı. Tüm gruplara enjeksiyonlar 10 gün boyunca tekrarlandı. Son doz verildikten 24 saat sonra, biyokimyasal ve histopatolojik incelemeler için tüm hayvanların anestezi altında intrakardiyak kan örnekleri alınıp böbrek dokuları çıkartıldı. Bulgular: Kolistine bağlı nefrotoksisite oluşturulan grupta toplam histolojik aktivite skoru diğer gruplarla kıyaslandığında anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0.0001). Diğer taraftan kolistin grubunda görülen histopatolojik belirtiler, NAS tedavisi uygulanan NAS+Kolistin grubunda istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldı. Buna göre, kreatinin düzeyleri kolistin grubunda artarken NAS+Kolistin grubunda kolistin grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldı (p<0.01). Kolistin grubunda artan apoptotik hücre sayısı NAS tedavisi uygulanan NAS+Kolistin grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede azaldı (p<0.0001). Histopatolojik incelemelerde tübüler nekrozun NAS+Kolistin grubunda kolistin grubuna oranla daha az olduğu gözlendi. Sonuç: Çalışmanın sonucunda, kolistinin böbrekte işlevsel ve yapısal hasarlara sebep olduğu, NAS tedavisinin ise bu hasarlara karşı iyileşme gösterdiği gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, kolistin, kreatinin, N-asetil sistein, nefrotoksisite.
Oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi ve karakterizasyonu
Oksalat taşları üriner sistemde biriken kalsiyum ve oksalik asidin oluşturduğu yapılardır. Oksalat taşları ileri zamanlarda böbrek taşı oluşturur ve erken tanısı için idrar oksalat seviyelerinin ölçülmesi önemlidir. Ülkemizde ve dünyada oksalat seviyeleri oksalat oksidaz ve oksalat dekarboksilaz olmak üzere iki farklı yöntem ile ölçülmektedir. Oksalat oksidaz yönteminde Oksalattan H2O2 ve CO2 açığa çıkarken, Oksalat dekarboksilaz yönteminde reaksiyon sonunda oluşan format'ın format dehidrogenaz enzimiyle parçalandığında açığa çıkan NADH+'nın spektrofotometrik yöntemle ölçülmesiyle oksalat miktarı tayin edilebilmektedir. Bu çalışmada, oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi hedeflenmiştir. Böylece elde edilen rekombinant oksalat dekarboksilaz enzimi ticari olarak satılan format dehidrogenaz enzimi ile birlikte kullanılarak oksalat tayininde kullanılacak bir ölçüm metodunun geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bunun için Basillus subtilis M168 suşundan elde edilen yvrK geni pET SUMO TA Cloning® vektör sistemi ile One Shot® Mach1™-T1R Escherichia coli ve BL21(DE3) One Shot® Escherichia coli mikroorganizmalarına aktarılarak klonlama ve protein ifadesi işlemleri yapılmıştır. Böylelikle elde edilen 6xHis-SUMO-yvrK füzyon proteini başarılı bir şekilde üretilmiştir. Gerekli kofaktör, optimum pH ve sıcaklık sağlanıp karakterizasyonu ve enzim aktivitesi belirtilmiştir. Ayrıca ticari olarak temin edilen format dehidrogenaz enzimi de kullanılarak idrarda oksalat miktarını ölçmekde kullanılabilecek enzimatik aktivitesi yüksek bir oksalat ölçüm metodu geliştirilmiştir.
Investigation of delayed type hypersensitivity response against crimean-congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein
Crimean–Congo hemorrhagic fever (CCHF) caused by CCHFV is reported in a wide geographic range with a fatality rate ranging from 5 to 50 %. CCHFV is a member of the family Bunyaviridae and classified in Nairovirus genus. CCHFV genome is composed of tripartite single-stranded negative RNA segments, and RNA dependent viral RNA polymerase is produced by L segment. S segment encodes nucleoprotein (NP) and M segment expresses Gn and Gc. To initiate the viral replication and transcription in the host cell, the segments are needed to be encapsidated by NP. The S segment of CCHFV encodes 53 kDa NP made up of globular domain with a prominent arm. CCHFV infection is generally reported as a mild, nonspecific febrile illness but in some cases, severe hemorrhagic disease is also developed. Persisting hemorrhage, multi-organ failure and shock result in fatality on day 5-14 of illness. In combatting against viral infections, CMI plays a pivotal role. Therefore it is essential to clarify the role of cellular immunity in CCHFV infection. In this study, we aimed to investigate the presence of delayet type hypersensitivity (DTH) reactions against CCHFV in an animal model. For this purpose, CCHFV NP (1449 bp), N-terminal part of NP, NPNT (387 bp) and C-terminal part of NP, NPCT (513 bp) were recombinantly produced in procaryotic expression systems and investigated their effect on DTH. Following immunization steps, antigens were injected in three different dosage (50 μg/μl, 100 μg/μl, 200 μg/μl) and footpad swelling was measured by an electronic caliper. For each protein, DTH response has peaked at 24 hr and decreased by 72 hr. Footpad swelling was statistically significant on right hind pad injected with antigen for each groups, compared to negative control (p<0,05). 100 μg/μl was found to be optimum dose for DTH response. The results of this study demonstrate that, CCHFV NP contains CD4+ T cell epitopes and N-terminal part of CCHFV NP developed stronger antigenicity than C-terminal part. Because, the exact role played by each protein in developing a cellular immunity against the whole virus have not been studied in detail, any information on the individual proteins and on the cellular immune response will be a wellcomed addition to the data on CCHFV. These information would be used in developing strategies in designing vaccines as well as on antiviral approaches.
Rekombinant yöntemlerle sentetik parathormon üretimi
Biyoteknoloji alanında üretilen ürünler içerisinde proteinler oldukça önem taşımaktadır. Rekombinant yöntemler kullanılarak sentetik olarak üretilen proteinler terapötik, endüstriyel ve bilimsel araştırma amaçlı üretimleri gerçekleştirilmektedir. Çalışmamızdaki amaç, rekombinant teknoloji kullanılarak terapötik kullanımını amaçladığımız parathormonu üretmektir. Parathormon (PTH) polipeptid yapısında 84 aminoasitlik (aa) tek bir zincir olarak paratiroid bezlerinden salgılanır. PTH'nin başlıca sorumluluğu, kemiklerden kalsiyum (Ca+2) emilimi ile plazma Ca+2 değerlerini düzenlemektir. Böbrekler ve bağırsaktan Ca+2 emilimi ve aynı zamanda fosfat (PO4−3) atılımınını sağlayarak, Ca+2-PO4−3 metabolizmasındaki homeostaziyi sağlamakta önemli bir role sahiptir. D vitamininin aktif formunun üretimi üzerine olan etkisi ile kalsiyumun bağırsaklardan emilimini kolaylaştırır. Hormonun az ya da çok salgılanması çeşitli sağlık sorunlarına neden olabilir. PTH'nin az salgılanmasıyla görülen en önemli endokrin rahatsızlık hipoparatiroidizm olarak adlandırılır. Çalışmamızda hipoparatiroidizme alternatif tedavi yöntemi olması planlanan sentetik PTH üretimi hedeflenmiştir. Bu çalışmada, hiperplazi dokudan alınan örnekten mesajcı ribo nükleik asit (mRNA) izolasyonu ve daha sonrasında komplementer deoksiribo nükleik asit (cDNA) eldesinin spesifik primerler ile DNA fragmentleri oluşturan, DNA polimeraz enzimi kullanılarak gerçekleştirilen polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) çalışmaları sonucunda PTH geni elde edilmiştir. Rekombinant PTH (rPTH) N-Terminal (1-84) kodlayan gen, PEGFP-N1(ökaryotik plazmid vektör) klonlama vektörüne sekresyon sinyalinin ardına yerleştirilip, moleküler klonlama teknikleri kullanılarak klonlanmıştır. Konak organizma olarak One Shot® Mach1™ T1R Escherichia coli kompetent suşu kullanılmıştır. Vektör içerisine aktarılan rPTH geni, hücre kültüründe HeLa (Henrietta Lacks, serviks kanseri) ve AGS (ATCC®CRL-1739™, Gastrik Adenokarsinoma) hücre hatlarına transfeksiyon ajanı ile 24 sa., 37 santigrat (˚C) ve %5 CO2 içeren etüvde inkübasyona bırakılmıştır. 24 sa.lik kültür sıvısından aktivasyon ölçümü ile PTH seviyesi ölçülmüş ve ekspresyon düzeyi sodyumdodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile değerlendirilmiştir. Bu çalışmada elde edilen sonuç ile medikal alanda çalışmaları sürdürülen sentetik PTH'nin elde edilmesi ile geliştirilen N- terminal (1-84) formülasyonu hipoparatiroidi tedavisi için umut verici olabilmesi ve rekombinant ilaç üretimi alanında bilimsel çalışmalara katkı sağlaması amaçlanmıştır.
Format dehidrogenaz enziminin candida boidinii'den moleküler olarak klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Modern biyoteknoloji endüstrisinde enzim üretimi önemli bir yer tutmaktadır. Klasik yöntemlerle bitkisel ve hayvansal kaynaklardan enzim eldesinin ekonomik olmaması, kalite ve miktar standardizasyonunun yakalanmasının zor olması gibi faktörler mikrobiyal kaynaklara olan eğilimi artırmıştır. Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesi ve mikroorganizmalarda kolaylıkla manipüle edilmesi ile birlikte rekombinant enzimlerin endüstriyel pazarının büyüyerek 2016 yılında 4.61 milyar dolara çıktığı açıklanmıştır ve 2017-2022 öngörü raporlarına göre %5.8'lik yıllık bileşik büyüme oranı ile 6.3 milyar dolara ulaşması beklenmektedir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (FDH, EC 1.2.1.2), format iyonlarını CO2'ye yükseltgeyerek NAD+ molekülünü NADH'a indirgeyen bir enzimdir. Enzimatik indirgemenin önemli olduğu reaksiyonlarda NAD(H) ve NADP(H) gibi pahalı kofaktörlere ihtiyaç vardır. Ekonomik alternatifler sunmak amacıyla kofaktörlerin geri dönüştürüldüğü metotlar dizayn edilmiştir. Bu metotlarda; kofaktör geri dönüşümünde hiçbir yan ürün biriktirmeyen, ana reaksiyonun substratına karşı inert olan böylelikle istenmeyen izomerler oluşturmayan, termodinamik denge olarak uygun olan, geniş pH aralığında çalışabilen, ucuz substratlara gereksinim duyan FDH enzimi sahip olduğu bu avantajlı özellikleri ile en çok tercih edilen enzimlerden biridir. Özellikle farmasötikler için önemli olan optikçe aktif bileşiklerin üretiminde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında tanılama testlerinde kullanımından dolayı FDH enziminin sentetik üretimi son yıllarda önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalar, çeşitli metilotrof maya ve bakterilerden FDH enziminin rekombinant olarak üretilebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada, Candida boidinii (C. boidinii) mayası ATCC 18810 suşunda FDH enzimini kodlayan gen bölgesinin rekombinant tekniklerle Escherichia coli (E. coli) bakterilerine klonlanması, gen ürünü olan proteinin eksprese edilmesi ve karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak C. boidinii mayasının genomik DNA'sı izole edilmiş, tasarlanan primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirilerek hedef FDH gen bölgesi çoğaltılmış ve beklenen 1104 bp'lik bant görülmüştür. Çoğaltılan gen TA klonlama metodu ile pTZR57R/T vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör pTZR57R/T+FDH ile E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücreleri transforme edilmiştir. Transformasyon gerçekleştikten sonra rekombinant vektör NdeI ve BamHI restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve hedef gen bölgesi ekspresyon vektörü olarak kullanılan pET-14b vektörü ile birleştirilerek E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyonun başarısı koloni PCR, restriksiyon enzim kesimi ve dizi analizleri ile onaylanmıştır. Sonrasında elde edilen rekombinant pET-14b/FDH vektörü ile ekspresyon hücresi olarak kullanılan E. coli One Shot® BL21 (DE3) hücrelerinin transformasyonu gerçekleştirilmiştir. FDH enziminin üretimi için gen ekspresyonu IPTG ile indüklenmiş, Ni-NTA afinite kolon kromatografisi ile hücredeki diğer proteinlerden ayrıştırılarak saf bir şekilde eldesi sağlanmıştır. Hedef proteinin varlığını görmek için SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapılmış ve beklenen 41 kDa'luk bant görülmüştür. Son olarak FDH enziminin ideal koşullardaki aktivitesini bulmak için testler yapılmış, enzimatik reaksiyon ürününün 340 nm'deki absorbans değerlerine bakılarak değerlendirme yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarının sonucunda; pH 8.0 Tris tampon çözeltisinde, 40 mM format substrat konsantrasyonunda, 60°C'a kadar olan sıcaklıklarda enzimin aktif olarak çalıştığı belirlenmiştir. Farmasötik endüstrisinde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bu enzim ülkemizde yurtdışı kaynaklardan temin edilmekte ve pahalıya mâl olmaktadır. Bu çalışma, NAD+-bağımlı FDH enziminin yerli olarak üretilmesi ve endüstriyel sahada büyük ölçekte üretime geçilmesi için veri sağlaması açısından önemlidir.
Işığa-duyarlı akıllı ilaç taşıyıcı sistemler: DNA-polimer ve protein-polimer konjugatlarının sentezi ve karakterizasyonu
Son zamanlarda özellikle kanser gibi önemli hastalıkların tedavisi için yeni metodların geliştirilmesine yönelik artan ihtiyaç sebebiyle, konvansiyonel ilaçların yerine daha etkili olabilecek ve hastaları daha az yan etkiyle tedavi edebilme potansiyeline sahip akıllı ilaç taşıyıcı sistemler geliştirilmektedir. Bu sistemler genellikle çeşitli polimerlerle oluşturulan nanoparçacıkların içine uygun ilaçların yüklenip hastalıklı bölgeye uygun hedeflendirmenin yapılarak ilacın tüm vücuda yayılmadan sadece istenilen bölgeye uygulanabileceği şekilde tasarlanmaktadır. Bu amaçla oluşturulacak taşıyıcı sistemlerin sentezinde uygun çözücüler içinde kendiliğinden birleşme özelliğine sahip amfifilik konjugatların kullanılması bu sistemlerin kolaylıkla elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Amfifilik yapıları oluşturmak için hidrofobik ve hidrofilik iki blok çeşitli konjugasyon yöntemleriyle bir araya getirilir. Bu yapılar tamamen sentetik polimerlerle hazırlanabilirken canlı ortamla uyumlu olmaları sebebiyle günümüzde hidrofilik blok olarak biyomakromoleküller daha yaygın olarak çalışılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada fotoaktif bir molekül olan kumarin içeren metakrilat monomeri ile tersiyer bütil akrilat monomerinin ATRP ile polimerizasyonu sonucu hidrofobik bir polimer bloğu elde edilmiştir. Hidrofilik blok olarak ise iki ayrı biyomakromolekül kullanılmıştır. İlk olarak 22 bazlı tek zincirli bir oligonükleotit ile hidrofobik polimerin CuAAC "click" reaksiyonu vasıtasıyla konjugasyonu yapılmış ve bu konjugatın karakterizasyonu için FT-IR, DLS ve UV ölçümleri alınmıştır. Bir diğer hidrofilik blok olarak ise BSA proteini kullanılmıştır. Hidrofobik polimer ile BSA'nın CuAAC "click" reaksiyonu vasıtasıyla konjuge edilmesinden sonra elde edilen konjugatın karakterizasyonu FT-IR, DSC, SDS-PAGE, UV ve floresans ile yapılmıştır. Daha sonra konjugatların distile su içerisinde misel oluşumu sağlanmış ve DLS ölçümleri ile bu misellerin parçacık boyutları belirlenmiştir. Miseller UV ışık altında (350 nm) 1 saat aydınlatılarak tekrar DLS ölçümleri yapılmış ve parçacık boyutlarındaki değişim gözlenmiştir.
Pluronik esaslı enjekte edilebilir hidrojeller
Geçmişten günümüze dek ilaç keşfi, ilaçların uygulama yöntemleri, ilaç salım sistemleri ve ilacın doz ayarlama stratejileri ile verimini artırmak gibi önemli konular sıkça çalışılmış olup özellikle 'kontrollü ve hedefli' biçimde, ilaçların istenilen bölgeye ulaşması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda çok sayıda strateji geliştirilmiş olsa da birçok çalışmada gerek toksisite, gerekse biyouyumluluk ve biyobozunurluk kriterlerine uyum konusunda sorun yaşanmıştır. Basit bir ilacın vücutta taşınmasından gen terapiye kadar söz konusu olan tüm süreçler için, onaylı, belli koşulları sağlamış, birbirinden çok farklı kökenlere sahip yapılar kullanılarak, çeşitli yöntemlerin ve sistemlerin oluşturulması hedeflenmiştir. Polimerik jeller, çapraz bağlı polimer zincirlerinin oluşturduğu ağ şeklinde yapı ve bu ağın içindeki çözücünün bir arada olduğu ikili sistemlerdir. Fiziksel özellikleri sıcaklık ve zaman değişimine bağlı olarak katı-sıvı arasındadır. Jeller, daha yüksek sıcaklıkta ve kısa zaman skalasında sıvı formdadır. Genel olarak, sıvı jeller viskoz davranış sergilerken, katı jeller elastik davranış sergilemektedir. Bu durum viskoelalastik davranış olarak ifade edilmektedir. Eğer bir jelin ağ yapısı içinde var olan sıvı ortam su ise, bu jeller hidrojel olarak adlandırılmakta olup bu yapılar üstün ve benzersiz özelliklerinden dolayı en önemli jel sistemlerindendir. Bu durumun temel sebepleri arasında hem kendi özelliklerinden dolayı gerçek doku ve organlara yüksek oranda benzerlikler göstermeleri hem de çoğu zaman jeli oluşturan temel moleküllerin istenilen özelliklere sahip seçilebilme, uyarlanabilme ve yönetilebilme gibi avantajları gösterilmektedir. Özellikle sıcaklığa ve pH'ya duyarlı hidrojeller, ayarlanabilir şişme ve ilaç salım özelliklerinden dolayı ilaç taşıyıcı sistemi olarak en çok tercih edilen hidrojel yapılarındandır. Blok kopolimerler bu hidrojel sistemlerinin oluşturulmasında kullanılan önemli polimer gruplarındandır. Bu polimer çözeltilerinin en önemli iki özelliği sıcaklığa bağlı miselleşmesi ve jel oluşumudur. Poloksamerler, diğer bir adıyla pluronikler, söz konusu blok kopolimer sınıfında olup, belli koşullarda jelleşme özelliğine sahip, hidrofilik ve hidrofobik bölgeleri sayesinde hem kendi içinde hem de moleküller arasında etkileşimler gösterebilen yapılardır. Pluronik sınıfının içerisinde en çok bilinen türlerinden olan Pluronik F127 (F127) polimeri, sıkça çalışılan hidrojel yapılarının temelinde rastlanan bir polimer grubudur. Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu (U.S. FDA) onaylı olan F127, gıda katkısı, kozmetik, ilaç endüstrisi gibi alanlarda çok farklı uygulamalarda kullanılmasına rağmen fiziksel etkileşimlerle biraraya getirilen bu jellerin mekanik dayanımlarının yetersiz olması ve fizyolojik çevrede çok hızlı çözünüyor olması en büyük dezavantajlarındandır. Bu durumu iyileştirmek amacıyla, karışık misel yapılarının kullanılması, farklı polimer zincirleri ile etkileşimlerin arttırılması, sisteme nanoparçacıkların eklenmesi veya iç-içe ağ yapılı sistemlerin oluşturulması gibi çok farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalışma kapsamında F127 esaslı, biyouyumlu, fiziksel çapraz bağlı, vücut ısısında jelleşebilen, muko-adeziv ve enjekte edilebilir ve en önemlisi mekanik dayanımları arttırılmış jel sistemleri oluşturulması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, F127 içeren çözeltilere sırasıyla hiyalüronik asit, siklodekstrinler ve türevleri, jelatin ve poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA)/polietilen glikol (PEG) yapıları katılarak dört farklı sistem üzerinde çalışılmıştır. Her bir formülasyon için değişen konsantrasyonlarda yapıların akış davranışları, enjekte edilebilirlikleri ve muko-adeziv özellikleri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Hedeflenen amaç doğrultusunda elde edilecek jellerin ilerleyen dönemlerde kulak cerrahi operasyonlarında kullanılması planlanmaktadır.
Sülforafanın 769-P insan böbrek kanser hücre dizisinde apoptoz üzerine etkisi ve hücre migrasyonunun inhibisyonu
Kanser görülme sıklığı dünyada giderek artmaktadır. Sağlıklı hücrelerde meydana gelen fenotipik ve genotipik değişiklikler sonucunda kanser meydana gelmektedir. Kontrolsüz hücre proliferasyonu sebebiyle hücreler anormal şekilde çoğalarak invazyon ve metastaz özelliği kazanırlar. Böbrekler metabolizma tarafından üretilen artık maddelerin vücuttan uzaklaştırılmasında ve homeostazın sağlanmasında önemli fonksiyonlara sahiptir. Böbrek kanseri; ürogenital kanserler içerisinde yer almakta ve insidansı gittikçe artmaktadır. Son yıllarda bitkisel kaynaklı besinlere olan ilgi artmaktadır ve geleneksel tedavileri desteklemek amacıyla sıklıkla tercih edilmektedir. Tarih boyunca da tedavilerde bitkisel gıdalar kullanılmış olup biyoaktif bileşenlerin aynı zamanda kanserin önlenmesinde farmakolojik ve fizyolojik etkilerinin olduğu savunulmaktadır. Diyetle alınan besinlerdeki kemopreventif bileşikler; hücre içi sinyal iletim yolaklarını düzenleme veya kanser oluşum sürecini uzatarak çeşitli koruyucu etkiler meydana getirmektedir. Brokoli, karnabahar, beyaz ve karalahana, Brüksel lahanası gibi Brassicaceae olarak da bilinen turpgiller ailesindeki sebzeler 'glukosinolat ' adı verilen bileşik içerirler. Glukosinolatlar, mirosinaz enzimi tarafından katalizlenen reaksiyona girerler. Parçalanma ürünü ise izotiyosiyanatın karakteristik bir bileşiği sülforafan (SFN)'dır. SFN kemopreventif etkileri sayesinde son yıllarda büyük ilgi görmektedir. Çok sayıda epidemiyolojik araştırmalar ile in vivo ve in vitro çalışmalar, SFN'nin kanseri önleyici ya da riskini azaltıcı potansiyeli olduğunu belirlemiştir. SFN'nin çeşitli hücre hatları üzerindeki proapoptotik etkileri tanımlanmıştır fakat literatürde böbrek kanserinde apoptoz üzerine olan etkisi için yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada SFN'nin 769-P insan böbrek kanser hücre hattı üzerindeki etkisi araştırılmış ve kontrol grubu olarak 293-T insan böbrek epitel hücre hattı kullanılmıştır. Bu amaçla çeşitli SFN konsantrasyonları hazırlanmış ve hücre hatları üzerinde etkileri incelenmiştir. Hücre proliferasyonu üzerine etkisinin gözlenmesi için MTT [3-(4, 5-dimetil tiyazol-2-il)-2, 5 difenil tetrazolyum bromid] testi (24. ,48. ,72. saat) ve sitotoksik etkinin belirlenebilmesi için LDH (Laktat dehidrogeneaz) testi uygulanmıştır. Analizler sonucu seçilen konsantrasyonlarda hücre döngüsü inhibisyonları saptanmıştır. SFN'nin hücrelerde meydana getirdiği apoptotik etkinin belirlenebilmesi için erken ve geç apoptotik hücreler Anneksin V yöntemi ile analiz edilmiştir. 769-P insan böbrek kanser hücre hattında ise doza bağımlı şekilde hücre migrasyonunun inhibisyonu incelenmiştir.
Işığa duyarlı kumarin fonksiyonlu amfifilik kopolimerlerin sentezi, karakterizasyonu ve ilaç taşıyıcı uygulamaları
İlaç taşıyıcı sistemler, terapötik aktiviteyi arttırırken yan etkileri en aza indirmeye duyulan ihtiyaçtan dolayı sürekli gelişmektedir. Son zamanlarda oldukça ilgi çeken ilaç taşıyıcı sistemlerinden biri dış uyaranlara duyarlı amfifilik blok kopolimerlerin sulu çözeltilerde kendiliğinden bir araya gelmesiyle oluşturulan misellerdir. Dış uyaranlara yanıt veren polimerler arasından ışığa-duyarlı olanlar özellikle ilgi çekmektedir. Foto-tersinir dimerleşme yapabilen ve polimerik sistemlerde yaygın olarak kullanılan bu yapılar genellikle uygun bir dalga boyundaki ışığın uygulanması ile tersine çevrilebilecek bir [4 + 4] - veya [2 + 2] - siklokatılma mekanizması ile ilerlemektedir. Kontrollü radikal polimerizasyon (KRP) tekniklerinin ve "click" reaksiyonlarının gelişmesiyle hassasiyet kazanan polimer sentezindeki ilerlemeler, polimerik yapıtaşlarının tasarlanmasında esneklik, çeşitlilik ve işlevsellik açısından muazzam imkanlar ortaya çıkmıştır. Bu çok yönlülük polimerik yapıtaşlarının kendiliğinden bir araya gelerek oluşturdukları nanoyapıların istenilen boyutta ve şekilde oluşturulmasını sağlamıştır. KRP tekniklerinin hidrofobik ve hidrofilik kopolimerlerin sentezinde kullanılan diğer basit tekniklere göre üstünlüğü, polimerlerin molekül ağırlığının, dizilişinin ve uç grup fonksiyonalitelerinin kontrolünü sağlamasıdır. Bu çalışmada, kontrollü polimerizasyon tekniklerinin ve "click" reaksiyonlarının avantajları kullanılarak ışık vasıtasıyla dimerleşebilen kumarin grupları içeren amfifilik bir blok kopolimer sentezlenmiş, bu kopolimer ile misel oluşturulmuş ve ilaç taşıma etkinliği incelenmiştir. Hidrofobik bloğu oluşturmak amacıyla glisidil metakrilat (GMA) monomeri tersinir katılma-ayrışma zincir transfer polimerizayonu (RAFT) vasıtasıyla polimerleştirilmiş, sonrasında glisidil fonksiyonları NaN3 ile azitlenerek "click" reaksiyonu vasıtasıyla belli bir oranda kumarin grupları takılmıştır. Elde edilen bu polimer PEG metakrilat monomerinin RAFT polimerizasyonunda makrobaşlatıcı olarak kullanılmış ve amfifilik kopolimer elde edilmiştir. Çalışma sırasında sentezlenen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV, floresan ve DSC ile karakterize edilmiştir. Son aşamada diyaliz yöntemi kullanılarak amfifilik kopolimer ile misel oluşturulmuş, ilaç taşıma etkinliğini belirlemek amacıyla da misellere doksorubisin (DOKS) yüklenmiştir. İlaç yüklü ve boş misellerin partikül boyutları DLS ile ölçülerek TEM görüntüleri sonucunda elde edilen boyutlarla karşılaştırılmıştır. Elde edilen miseller ayrıca 350 nm dalgaboyunda aydınlatılarak meydana gelen değişiklikler gözlenmiştir.
İlaç taşıyıcı olarak fotoduyarlı amfifilik yıldız kopolimerlerin sentezi ve karakterizasyonu
Son yıllarda ilaç etkinliğini arttırma, hedefli taşıma ve özellikle kanser terapötiklerinin yan etkilerini en aza indirgeme avantajları sebebi ile ilaç taşıma sistemleri ön plana çıkmış ve bu alandaki çalışmaları arttırmıştır. Bunula birlikte, özellikle dış uyaranlara yanıt veren amfifilik blok kopolimerlerin oluşturduğu miseller ilgi çekmektedir. Doğrusal polimer analoglarına kıyasla avantajlı özellikleri barındıran yıldız kopolimerlerin geliştirilmesi önem kazanmıştır. Kontrollü radikal polimerizasyon teknikleri ile istenilen boyutta ve işlevsellikte polimer yapılarının elde edilmesi ile misel yapılarının geliştirilmesi sağlanmıştır. Işığa duyarlı misellerin oluşturulması ile misel stabilizasyonu, salım mekanizması ve hedefleme gibi özellikler elde edilmeye çalışılmaktadır. Bu çalışmada, kontrollü polimerizasyon tekniği kullanılarak ışık vasıtası ile dimerize olabilen antrasen grupları bulunduran amfifilik yıldız blok kopolimeri sentezlenmiş, bu kopolimer ile misel oluşturulmuş ve miselin ilaç taşıma etkinliği incelenmiştir. Hidrofobik yıldız kollarını oluşturmak amacıyla metil metakrilat ve antrasen metakrilat monomerleri birlikte atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) ile polimerleştirilmiştir. Elde edilen bu polimer poli(etilen glikol) metil eter metakrilat monomerinin ATRP polimerizasyonunda makrobaşlatıcı olarak kullanılmış ve amfifilik yıldız blok kopolimer elde edilmiştir. Çalışmada sentezlenen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV-Vis ve DSC ile karakterize edilmiştir. Bir sonraki aşamada, diyaliz membran yöntemi kullanılarak amfifilik kopolimer ile misel oluşturulmuş ve daha sonra ilaç taşıma etkinliğini belirlemek amacıyla misellere doksorubisin (DOKS) yüklenmiştir. Boş ve ilaç yüklü misellerin partikül boyutları DLS ile ölçülerek TEM görüntüleri sonucunda elde edilen boyutlarla karşılaştırılmıştır. Son aşamada, DOKS yüklü misellerin in vitro ilaç salım profilleri incelenmiştir.
Anti-oksidan doğal bileşiklerin kemoterapi ajanı paclitaxel ile birlikte nano misellere yüklenmesinin etkinlik ve toksisite profili açısından in -vitro ortamda gözlenen olası değişiklikler
Kemoterapi tedavisinde kullanılan kemorerapötik ajanlar sadece kanser tümöründe etki etmek ile kalmayıp, sağlıklı bölgelerde de toksik etkilerin oluşmasına sebep olabiliyorlar. Bu maddeler yan etkilerini zaman zaman oksidasyon ile göstermektedirler. Bu noktadan hareketle bazen kanser tedavisinde kemoterapi sırasında hastalara antioksidan doğal ürün tüketmeleri tavsiye edilmektedir. Ancak bu antioksidan maddelerin kanser tümör bölgesinde kemoterapi ajanının yarattığı oksidasyon etkisini azaltabilir ve kemoterapi ajanının tam olarak etki göstermesine engel olabilir. Bu konu aydınlığa kavuşturulmalıdır. Bu noktadan hareketle antioksidan etkisi olan curcumin, quercetin ve rosmarinik asit bileşiklerin kemoterapi ajanı paclitaxel ile birlikte kanser hücrelerine uygulanıp bu ajanın etkisini hangi yönde değiştirdiği araştırılmıştır. Bunun için adı geçen doğal antioksidanlar bileşikler nano-taşıyıcılara yüklenip paclitaxel ile birlikte meme kanseri hücreleri üzerinde ne yönde etki gösterdiği araştırılmıştır. Doğal antioksidanların nano-taşıyıcıya yüklenme sebebi ise bu maddelerin düşük sudaki çözünürlüğünün giderilerek yüksek oranda hücrelere uygulanabilmesidir. Bunun için polylactidecoglycolide (PLGA) nano-miselleri kullanılmıştır. Paclitaxel'in ise suda çözünür ticari formu hücrelere uygulanmıştır. Her antioksidan maddenin nano-formülasyonu ayrı ayrı o/w yöntemi kullanarak hazırlanmıştır. Bunun için antioksidan ile PLGA birlikte aseton içinde çözünmüş ve yüzey aktif madde içeren suya yavaşça damlatılmıştır. Organik çözücü gece boyunca karıştırılarak oda sıcaklığında uzaklaştırılmıştır. Elde edilen nano fomülasyonların boyutları DynamicLightScattering (DLS) yöntemi ile tayin edilmiştir. Anti oksidanlar artan konsantrasyonlarla nano-taşıyıcıya yüklenmiştir ve agregat gözlenmeyen en yüksek konsantrasyon yani tüm bileşiğin miselin içine yüklendiği formülasyon optimize formülasyon olarak kabul edilmiştir. Paclitaxel'in IC 50 değerine eşit miktarda konsantrasyonu nano-anti oksidanların çeşitli konsantrasyonları ile birlikte MCF-7 insan meme kanseri hücrelerine uygulanmış ve hücre canlılığındaki değişimler gözlenmiştir. Hücre canlılığı SulforhodamineB testi ile ölçülmüştür. Ayrıca nano-anti oksidan paclitaxel ile birlikte, paclitaxel'den 1 saat önce ve paclitaxel'den 1 saat sonra hücrelere uygulanmış ve böylece uygulama zamanının sonuçlarda ne gibi değişiklik yaratabileceği de incelenmiştir. Sonuç olarak kürkümin'in Paclitaxel'in anti-tumor etkisini büyük oranda azalttığı gözlenmiştir. Quercetin ise doza bağlı bir şekilde paclitaxel'in anti-tumor etkisini azaltmıştır. Rosmarinik asitin ise belirgin bir etkisi tespit edilmemiştir. Uygulama zamanının ise bu etkilerin değişimi üzerinde bir fonksiyonu olmadığı gözlenmiştir. Nihai olarak anti oksidanın biyo-yararlanımı ve kandaki konsantrasyonu bilinmediği müddetçe tümör bölgesinde hangi oranda bulunacağı da meçhul kalacaktır denebilir. Bu da xii doğal anti oksidanın kemoterapinin etkisini tümör bölgesinde hangi yönde etkileyeceğinin bilinmemesine sebep olacaktır. Buradan yola çıkarak, anti oksidanların kemoterapi ajanının etkisi ve nihai olarak kanser tümörünün büyümesi üzerindeki olumsuz etkisi tam anlaşılmadan kanser tedavisi süresince kullanılmaması gerektiği kanısına açıkça varılabilir.
Kırım kongo kanamalı ateş virüsü kelkit suşu gc glikoproteininin ökaryotik ekspresyon sisteminde üretilmesi
Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü (KKKAV) keneler aracılığı ile taşınan bir virüs olup Afrika, Asya, Doğu Avrupa ve Orta Doğu'da etkili olan mortalite oranı %30'lara ulaşabilen bir kanamalı ateş etkenidir. KKKAV, Bunyaviridae ailesinin Nairovirüs cinsine ait olan zarflı, tek sarmallı, negatif polariteli bir RNA virüsüdür. Kene ile taşınan virüsler arasında en geniş coğrafi yayılıma sahip olması ve Dengue virüsten sonra medikal anlamda en önemli ikinci arbovirüs olması sebebi ile dikkat çekmektedir. Bunyaviridae ailesinin diğer üyelerinde olduğu gibi KKKAV'de üç adet yapısal protein barındırmaktadır. Üç segmentli bu virüsün small (S) segmentinden nükleoprotein, large (L) segmentinden RNA-bağımlı-RNA polimeraz, medium (M) segmentinden ise Gn ve Gc olmak üzere iki adet yapısal glikoprotein kodlanmaktadır. M segment open reading frame (ORF)' inden 1684 aminoasit uzunluğunda bir poliprotein üretilir. Ardından SKI-1 ve SKI-1 like proteaz ile Pre-Gn ve Pre-Gc ve posttranslasyonel kesimler sonucunda 37 kDa boyutunda Gn ve 75 kDA boyutunda Gc glikoproteinleri oluşmaktadır. Hücre yüzey reseptörleri ile etkileşime geçmeleri, virüsün konak hücreye girişini sağlamaları ve nötralizan antikorlar için hedef olmaları sebebi ile viral glikoproteinler virüslerin yaşam döngüsünde önemlidir. KKKAV'de nükleokapsit proteininin immunolojik özellikleriyle ilgili çalışmalar literatürde nispeten bulunmasına rağmen, bu virüsün glikoproteinleri Gn ve Gc'ye yönelik çalışmalar yeni yeni ortaya konmaya başlanmıştır. Bu çalışmada KKKAV glikopretini Gc'ye karşı humoral immün yanıtın araştırılması için fonksiyonel bir rekombinant protein üretmek hedeflenmiştir. Bu amaçla Pichia pastoris'te üretilip saflaştırılan Kelkit suşuna özgü Gc'nin otantik antijeniteye sahip olduğu, KKKAV infeksiyonu geçirmiş insan serumlarıyla yapılan Western blot ve EIA testleriyle gösterilmiştir. Gc'nin antijenitesi tavşan ile yapılan deneylerle de gösterilmiştir. Çalışmamızın sonuçları P. pastoris'in KKKAV glikoproteini Gc'yi üretmek için uygun bir model organizma olduğunu göstermiştir. Ayrıca KKKAV glikoproteini Gc'ye özgü antikorların KKKAV infeksiyonu geçirmiş hasta serumlarında ve inaktif virüs ile infekte tavşan serumu içerisinde bulunduğu tespit edilmiştir. P. pastoris'te rekombinant olarak üretilen Gc ile diyagnostik ve bağışıklama alanlarında daha ileri düzey işlevsel çalışmalar gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü; glikoprotein; maya; Pichia pastoris
PLGA naopartiküllerinin ve çeşitli karbonhidratlarla birleşmesinden oluşan türevlerinin hücre içine giriş yolaklarının incelenmesi
Kanser hastalığı, hücrelerin kontrolünü kaybederek aşırı şekilde bölünmesidir. Kontrolsüz olarak çoğalan bu hücreler bulunduğu bölgede birikmeye başlarlar ve tümör denilen yapıyı oluştururlar. Nano taşıyıcı kullanarak geleneksel tedavilere nazaran daha iyi tedavi sonuçları elde edilmişken, nano taşıyıcının içinde taşıdığı kemoterapi ajanıyla birlikte hücre içine girişi büyük önem taşımaktadır. Bu tezde hücrelerin maddeleri hücresel içe alım yolaklarından ve kanser hücrelerinin hızlı metabolizmalarından yararlanılarak laboratuvarda hazırlanan PLGA nano taşıyıcısının kanserli hücreler tarafından nasıl alındığı incelenmiştir. Böylelikle ileriki çalışmalarda tespit edilen hücre içine giriş yolağı daha çok kullanarak daha etkin tedaviler elde edilebilir. Kanser hücreleri beslenmek açısından alternatif enerji kaynakları bulsa da öne çıkan en büyük değişiklik glikoliz mekanizmasındaki değişikliklerdir. Kanser hücreleri Warburg etkisi ile hızlıca glikoz kaynağına ulaşmak ister. Bu isteği kullanarak nano taşıyıcı sistem olarak kullanılacak olan PLGA (poli laktik asit ko glikolik asit), glikoz ve früktoz türevi olan selüloz ve levan ile kaplanarak MCF-7 meme kanserli hücre ortamına verilmiştir. Böylelikle MCF-7 meme kanseri hücrelerinin PLGA nano taşıyıcısına olan ilgisinin arttırılması planlanmıştır. Ayrıca, nano taşıyıcı hücre giriş yolakları olan klatrin aracılıklı endositoz, klatrinden bağımsız endositoz, makro pinositoz ve fagositoz yolaklarını inhibe edecek gerekli inhibitörlerle beraber verilerek nano taşıyıcının giriş yolları incelenmiştir. Her bir hücre için giriş yolağının literatürde mevcut olan farmakolojik veya kimyasal inhibitörü mevcuttur. Bu amaç için MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanılmıştır. PLGA nano taşıyıcısı FITC işaretli olacağından floresan mikroskopu ile takip edilebilmiştir, detaylı ölçümler ELISA cihazı ile gerçekleşmiştir. Kullanılacak selüloz kaplı PLGA, levan kaplı PLGA, FITC işaretli PLGA ve PLGA nano taşıyıcılarının boyut analizleri DLS cihazıyla ve yükleri Zeta potansiyeli ile analiz edilmiştir. İnhibitör ve nano taşıyıcıların toksisite çalışmaları da Sulforhodamine B canlılık testi ile kontrol edilmiştir. Tüm nano taşıyıcı sistemler, buharlaştırma ve çöktürme yöntemiyle hazırlanmıştır. FITC işaretli PLGA levan ve selüloz ile kaplanmıştır ve bunun FITC işaretli ve işaretsiz kaplanmamış PLGA nano taşıyıcıları hazırlanmıştır. İnhibitörlerin ve nano taşıyıcıların toksik olmayan dozları ölçülmüştür. Hücreler önce inhibitörlere maruz bırakılmış, aha sonra nano taşıyıcılar ile muamele edilmiştir. İnhibitöre maruz kalmayan hücreler kontrol olarak kullanılmıştır. İnhibitörler en çok, kaplanmamış PLGA nano taşıyıcılarının hücre içine girişini etkilemiştir bu da kaplanmamış nano taşıyıcının hücre içine girişi için daha çok yolak kullandığını göstermektedir. Selüloz ile kaplanmış PLGA ve levan ile kaplanmış PLGA açısından, chlorpromazine en yüksek oranda hücre içine giriş engellemiştir bu da kaplanan nano taşıyıcıların hücre içine giriş için klatrinden bağımsız endositozu kullandığını göstermektedir.
Tasarımla kalite (qualıty by desıgn (QBD)) yaklaşımıyla plga nanopartiküllerinin endüstriyel üretimine yönelik metot geliştirilmesi
Nanopartiküllerin endüstriyel üretimine yönelik var olan bilgi ve araştırma eksikliği bu taşıyıcıların farmasötik pazarına girişini engelleyen büyük bir etkendir. FDA tarafından altın standart olarak kabul edilen, biyouyumlu ve biyobozunurluk avantajlarıyla öne çıkan PLGA nanopartiküllerinin konvansiyonel olarak birçok üretim yöntemi olmasına karşın bu yöntemler endüstriyel ölçekte üretime uygun değildir. Kullanılan en yaygın yöntemlerden olan emülsiyon oluşturma-çözücü buharlaştırma işlemi, şırınga ile organik fazı su fazına yavaşça damlatma basamağından dolayı büyük ölçekler için uygun bir yöntem olmaktan çıkar. Yüksek basınç homojenizatörü prensibi ile çalışan Microfluidizer teknolojisi 'kendiliğinden düzenlenen (self assembly)' sistemlerin endüstriyel üretimi için uygun cihazlardır. Microfluidizer, doğrusal hacimsel ölçeklendirme sayesinde pilot üretimde geliştirme aşamalarından tasarruf sağlar ve scale-up garantisini sunar. Microfluidizer teknolojisi dar partikül boyut dağılımı sonuçları üreterek daha fazla stabilite, daha uzun raf ömrü ve verimli ham madde kullanımı sağlar. Bu çalışmada formülasyon parametreleri tasarımla kalite yaklaşımı ile optimize edilirken PLGA nanopartikülleri Microfluidizer cihazı yardımıyla pilot ölçekte üretilmiştir. FDA tarafından başlatılan, Tasarımla Kalite, önceden belirlenen hedeflere dayanan ve ürünün ilk safhasından ticarileştirildiği son safhasına kadar kontrolünü sağlayan bir yaklaşımdır. Tasarımla kalitenin temelini deneysel tasarımlar oluşturmaktadır. Merkezi kompozit tasarım ile cihaz ve formülasyon faktörleri belirlenip 60 formülasyon için deneysel matriks oluşturulmuştur. Faktör ve tepkilerle ilgili polinom denklemleri oluşturulduktan sonra Minitab 17 yazılımı ile PLGA nano ilaç taşıma sistemi ortalama partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve PdI açısından optimize edilmiştir. İstenen limitler ortalama partikül büyüklüğü, zeta potansiyel ve PdI için minumum standart sapmalar olarak belirlenmiştir. Bu cevaplar sayesinde optimize PLGA miktarı, T80 miktarı, basınç seviyesi ve geçiş seviyeleri belirlenmiştir. Modelin validasyonu için endüstride sıkça kullanılan istenirlik endeksinden yararlanılmıştır. Kompozit istenirlik değeri 0,955 olarak elde edilip böylece modelin ve optimize edilmiş değerlerin hedefe iyi bir şekilde ulaştığı gösterilmiştir. Enjekte edilebilir (200 nm'den az), kararlı (zeta potansiyel -20 mv'den yüksek) ve dar bir PdI değeri (0,2'den az) ile PLGA nanopartikülleri elde edilmiştir. Anahtar kelimeler : Microfluidizer, tasarımla kalite, pilot ölçek, PLGA, merkezi kompozit tasarım
Renal hücre karsinomunda aday tümör baskılayıcı BNC1, SCUBE3, SFRP1 ve PCDH8 genlerinin epigenetik analizi
Kanser; vücudun bir organ veya dokusunda beliren bazı anormal hücrelerin kontrolsüz ve düzensiz bir şekilde proliferasyonu sonucu oluşan bir hastalıktır. Bu hücreler bir araya gelir ve tümör olarak isimlendirilen bir kitle oluştu¬rur. Kanser oluşumu; bir hücrenin, genetik yapısında ardı ardına oluşan kalıtılabilir değişikliklerin birikmesi sonucu, büyüme avantajı kazanması ile açıklanabilir. Bu süreçte etkili iki sınıf genden bahsedilir, bunlar onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerdir. Her iki grup gende gözlenen değişiklikler kansere yol açabilir. Çevresel faktörlerin de etki ettiği kanser, genetik ve epigenetik değişiklikler sonucu oluşan bir süreçtir. Bu epigenetik değişikliklerin başında metilasyon gelmektedir. Yapılan pek çok çalışma, çok sayıda kanser türünün oluşumunda bazı genlerin hipermetilasyonlarının etkili olduğu vurgusunu yapmaktadır. Böbreklerde değişik tiplerde kanser gelişebilir.Renal hücreli karsinom (RHK) böbrek tümörlerinin içinde en yaygın olanıdır. RHK tüm kanserlerin %2-3'lük kısmını oluşturmaktadır. En yüksek insidans, gelişmiş ülkelerde görülür. Tüm dünyada ve Avrupa'da hastalığın insidansında yıllık yaklaşık %2 oranında artış gözlenmektedir. RHK, böbrek içinde en sık gelişen kitlesel lezyondur. Bu çalışmada amaç, RHK hastalarında BNC1, SCUBE3, SFRP1, ve PCDH8 genlerinin promotör bölgelerindeki metilasyon durumunun tespit edilmesidir. Toplamda 24 hastanın parafine gömülü tümör dokusu ve komşu normal dokusundan izole edilen DNA örneklerinde bisülfit dönüşümü yapıldıktan sonra Metilasyon Spesifik PCR yöntemi uygulanmıştır. Sonuç olarak; BNC1, SCUBE3, SFRP1, ve PCDH8 aday tümör baskılayıcı genlerdeki promotör bölge metilasyonunun RHK patogenezinde etkili olabileceği düşünülebilir. Ancak bu sonuçların kesinleşmesi için farklı moleküler tekniklerle yapılacak çalışmalara gereksinim vardır.
Meme kanseri tedavisi için yeni bir polimerik ikili ilaç taşıma sisteminin geliştirilmesi
Kanser tedavisinde kullanılan konvansiyel yöntemlerinin sistemik etkiye sahip olması bundan dolayı kanserli hücrelerin yanı sıra sağlıklı hücrelerin de olumsuz olarak etkilenmesi ilaç taşıyıcı sistemler üzerine yapılan çalışmaların giderek artmasını sağlamıştır. Kemoterapötik ajanların düşük çözünürlükleri, yüksek toksisiteleri, düşük stabiliteye sahip olmaları tedavinin etkinliğini sınırlamaktadır. Polimerik ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi antikanser ilacı tümör bölgesine hedeflemeyi sağlamakta ve yan etkileri azaltmaktadır. İkili ilaç taşıyıcı sistemlerin kanser tedavisinde kullanılarak sinerjestik etkiye sahip antikanser ajanların bir arada verilmesiyle tedavinin etkinliğini arttırılmaktadır. Akciğer kanserinden sonra en sık görülen ikinci kanser çeşidi olan meme kanserinde cerrahi tedavi, radyoterapi, hormone terapi ve kemoterapi tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır. Kemoterapötik ajan olarak kanser tedavisinde kullanılan alkilleyici bir ajan olan Gemsitabin ve platin türevi bir antikanser ilaç olan Cisplatin'in bir arada kullanılması meme kanseri üzerindeki sitotoksik etkiyi arttırdığı bilinmektedir. Bu çalışmayla birlikte Gemsitabin ve Cisplatin yüklü nanopartiküllerin sentezi gerçekleştirilmiş ve nanopartiküllerin MDA-MB-231 meme kanseri ve CCD-1079Sk sağlıklı fibroblast hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Literatüre bakıldığında Cisplatin ve Gemsitabin antikanser ilaçların bir arada kullanılarak meme kanserini hedef alan ilaç taşıyıcı sistemin geliştirilmesi üzerine yapılan çalışmalar sınırlıdır. Araştırma düşük doz kullanımıyla yan etkilerin azaltılması ve meme kanseri hedefli bir polimerik ikili ilaç taşıyıcı sistem geliştirilmesini amaçladığından kadınlarda en sık görülen kanser tipi olan meme kanserinin tedavisindeki etkinliğin arttırılması açısından önem taşımaktadır. Yeni bir polimerik ikili ilaç taşıma sisteminin literatüre kazandırılması çalışmayı ayrıca önemli kılmaktadır.
Ex vivo gen terapisiyle hipoparatiroidizm tedavisi modeli oluşturma
Hipoparatiroidi (hipo-PT), vücuttaki parathormon (PTH) eksikliği sebebiyle başlıca kalsiyum seviyesindeki düşüş ve fosfat seviyesindeki artışın eşlik ettiği, yaşamın devamı için mutlaka tedavi edilmesi gereken bir hastalıktır. Kronik hipo-PT'nin konvansiyonel tedavisinde yüksek dozlarda oral Ca ve D vitamini takviyelerinin ömür boyu kullanımı zorunludur. Söz konusu tedavi küratif olmayıp semptomatik olmakla beraber, uzun vadede kullanımında hastada çok ciddi yan etkiler görülebilmektedir. Bu sebeple hipo-PT için yeni ve alternatif terapi yaklaşımlarının geliştirilmesinin gerekliliği açıkça görülmektedir. Gen terapisi, özellikle küratif tedavisi bulunmayan hastalıklar için kullanılabilecek olan, son yıllarda yenilenen vektör tasarımlarıyla birlikte hem güvenilirliğinin hem de etkinliğinin arttırılmış olduğu bir terapi metodudur. Bu sebeple çalışmamızda, sıçanlar üzerinde ex vivo gen terapisi metoduyla hipoparatiroidi tedavisi modeli oluşturabilmenin mümkün olabileceğinin gösterilebilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamız hipo-PT tedaviside hem "otolog primer hücrelerin kullanıldığı ilk ex vivo gen terapisi" çalışması olup, hem de söz konusu hastalığın tedavisinde vektör olarak "lentiviral vektörler"in kullanılmış olduğu ilk çalışmadır. Daha önce sıçanlar üzerinde hipo-PT için gen terapisi çalışmaları gerçekleştirilmiş olsa bile, söz konusu çalışmalarda in vivo yöntem kullanıldığından, terapötik genin vücutta dağılabileceği hücreleri/dokuları tahmin edebilmek mümkün değildir. Oysa ex vivo gen terapisi çok daha güvenli ve kontrollü bir uygulama sağlayabilmektedir. Çalışmamızda ayrıca otolog hücrelerin kullanımı sayesinde immun reddin de önüne geçilebilmesi amaçlanmıştır. Tezimizde her bir deney hayvanından alınan deri parçasından, hayvanın kendine ait otolog primer hücreler kültüre edilerek çoğaltılmış ve insan parathormon geni (hPTH) taşıyan lentiviral vektörler üretilerek, söz konusu otolog hücreler lentiviral vektörlerle transdükte edilmiştir. Transdüksiyon sonrası hücrelerin hPTH genini genomlarına entegre ederek yüksek miktarda biyolojik aktif hPTH üretimi ve salgılaması yaptığı floresan mikroskop görüntüleri ve biyokimyasal testler sayesinde doğrulanmıştır. Söz konusu hücreler sıçan vücuduna subkutan olarak enjekte edildikten sonra ise tüm deney hayvanlarında hPTH üretimi doğrulanarak, sıçanlarda ex vivo gen terapisi ile hipo-PT tedavisinin mümkün olabileceği gösterilmiştir. Ancak terapi sonrası sıçan serumundan ölçülen hPTH değerlerinin, sıçanlardaki fizyolojik PTH referans değer aralığının altında kaldığı görülmektedir. Bunun sebebinin terapötik hücrelerin enjeksiyon sonrasında sadece çok az bir kısmının vücuda engrafte olabilmesi, büyük bir kısmının ise engrafte olamadığı için vücuttan uzaklaştırılması ve bu yüzden hormon seviyelerinin fizyolojik referans değer aralığının altında kalması olduğu düşünülmektedir.
PTCH1 geninde meydana gelen epigenetik değişimlerin mide kanserli olgularda incelenmesi
Gastrik kanser (GC) dünyada teşhisi konulan dördüncü en sık kanser olmakla beraber, mortalitesi yüksek ve prognozu kötü bir malignitedir. Yapılan moleküler çalışmalarda, hedhehog sinyal yolağının bir proteini olan PTCH1 reseptör regülasyonunun bozulmasının mide kanserine sebep olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada cerrahi gastrektomi uygulanmış mide kanserli olgulardan rezekte edilen tümör dokularında, PTCH1 geninin epigenetik değişimi ve buna bağlı olarak ortaya çıkan ekspresyonel farklılıkların incelenmesi amaçlanmıştır.Çalışmaya, gastrik kanser tanılı, 50-70 yaş aralığında, 13 erkek ve 9 kadın hastadan cerrahi gastrektomi ile rezekte edilmiş tümör dokusu ve tümörden uzak bir bölgeden alınmış kontrol dokusu dahil edildi. Elde edilen dokulardan ticari izolasyon kiti yardımıyla DNA izole edildi. İzole edilen DNA'ların konsantrasyonları belirlendikten sonra uygun koşullarda bisülfit dönüşümü yapıldı ve EpiTect Metil 2 PCR Sistemi yardımıyla metile ve metile olmayan primerler kullanılarak kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile PTCH1 genindeki metilasyon profilindeki değişimler belirlendi. Protein düzeyindeki değişimler için homojenize doku örneklerinden ELISA yardımıyla PTCH1 protein ekspresyonları ölçüldü. RT-PCR sonucunda metile primerlerin kullanıldığı düzenekte çoğunlukla tümör dokusundan elde edilen örneklerin erime sıcaklığı ile tümör uzak dokulardan elde edilen örneklerin erime sıcaklığı arasında yaklaşık 0.5 ± 0.25 derece değişimin olduğu ve bu nedenle tümörlü dokuların metilasyon profillerinin sağlıklı dokuya oranla değiştiği tespit edildi. Protein ekspresyonu sonuçları değerlendirildiğinde PTCH1 protein miktarının kanserli dokularda anlamlı derecede arttığı tespit edildi (p<0,05). Elde edilen sonuçlar gastrik kanser oluşumunda etkisinin olabileceği düşünülen ve PTCH1 genindeki metilasyon profilinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim görülmediğinden PTCH1 proteinindeki değişimin direk epigenetik değişimler ile ilişkili olmadığını düşündürmektedir. Bu nedenle, bu sonuçlar çevresel etkiler sonucu oluşan epigenetik değişimlerin gastrik kanser oluşumunda etkisinin sınırlı olduğuna işaret etmektedir.
Likit biyopside glioblastoma multiforme genetik biyobelirteçlerinin araştırılması
Glioblastoma multiforme hastalarının likit biyopsi örneklerinde genetik biyobelirteçlerin yakalanması ve keşfi
İnsan solunum sinsityal virüsünün protein dizisi çeşitliliği dinamiklerinin incelenmesi
İnsan solunum sinsityal virüsü (hRSV), dünya çapında en bulaşıcı virüslerden biridir ve bronşiolit ve pnömoni gibi alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açabilir. Lisanslı profilaktik hRSV aşısı bulunmamaktadır. hRSV'nin büyük ölçekli proteom çapında dizi çeşitliliği analizinde kullanılacak ve epitop bazlı hRSV aşı tasarımı için potansiyel aşı hedeflerinin tanımlanmasına yol açacak çok sayıda hRSV dizisi halka açık veri tabanlarında mevcuttur. Bu çalışma, virüsün mevcut tüm protein dizilerine odaklanmıştır. Dizi verileri, halka açık NCBI Virüs ve Virüs Patojen Veritabanı ve Analiz Kaynağı (VIPR) veritabanlarından toplanmıştır. Protein dizisi verileri havuz oluşturularak birleştirilmiş ve benzer diziler CD-HIT kullanılarak çıkarılmıştır. Bireysel protein veri kümeleri oluşturmak için 11 hRSV proteininin UniProt referans kayıtları kullanılarak toplanan diziler üzerinde BLASTp analizi yapılmıştır. Her protein veri seti, MUSCLE programı kullanılarak hizalanmıştır. Dizi çeşitliliği, proteinin uzunluğu boyunca örtüşen her 9-mer (nonamer) (1-9, 2-10, vb.) pozisyonu için Shannon entropisi kullanılarak ölçülmuştür. Bundan sonra, T-hücre epitopları, IEDB veritabanı kullanılarak deneysel olarak ispatlanan epitoplar ile eşleştirilmiş ve IEDB'nin önerdiği yardımcı araçlar kullanılarak epitop tahmini yapılmıştır. Tahmin sonuçlarımızı desteklemek için, seçilen epitopların MHC I ve II'ye karşı moleküler docking analizleri ve moleküler dinamik simülasyonları yapılmıştır. VIPR ve NCBI Virus veritabanlarından toplanan toplam dizi sayısı 93.382'dir. Benzer dizilerin çıkartılmasından sonra, sayı 12.413'e düşmüştür (~%87'lik bir azalma). hRSV için gözlemlenen maksimum entropi değeri, M2-2 proteininde 43'üncü nonamer pozisyonunda ~4.2 olarak bulunmuştur. Bununla birlikte, proteom çapında ortalama entropi genel olarak düşüktür (~0.8) ve bu nedenle yüksek korunmuşluk göstermektedir ve bu değerler ~0.5 ( protein N) ile ~2.3 (protein M2-2) arasındadır. Varyantların çoğu (~%55) 0 ile 1 entropi aralığı arasındadır. Nonamer pozisyonlarının yaklaşık yarısı (~%51) yüksek oranda korunmuş olarak sınıflandırılmıştır (indeks insidansı ≥ %90). Epitop tahmini için 2269 yüksek oranda korunmuş nonamer dizisi seçilmiştir. 2269 nonamer dizisinden, sırasıyla MHC Sınıf I ve II için 997 ve 235 epitop tahmin edilmiştir. Bu çalışma, hRSV proteomundaki dizi çeşitliliği ve bunların potansiyel aşı hedefleri hakkında bilgi sağlamaktadır. Proteomun ve tahmin edilen epitoplarının yüksek düzeyde korunması, profilaktik hRSV aşı tasarımı için daha fazla araştırmanın gerekliliğini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Viral dizi analizi, immünoinformatik, aşı hedef keşfi
Glioblastoma hücrelerinde integrin α10'un PLGA nano partiküllerine yüklenmiş siRNA ile baskılanması
Kanser, dünyada ölüm nedenlerinin başında gelen bir hastalıktır ve birçok çeşitleri bulunmaktadır. En tehlikeli kanser sınıfına dahil olabilecek bir kanser türü de glioblastoma kanseridir ve beyin çevresine yayılabilen en yaygın ve ölümcül bir tümördür. Histolojik olarak nekroz ve endotel proliferasyon ile tanımlanan glioblastoma, yetişkin bireylerde görülen en yaygın ve agresif birincil beyin tümörüdür. Tanı ve tedavisinde birçok zorluk yaşanmaktadır. Bu olumsuzlukları en aza indirgemek amacıyla nano taşıyıcı sistemler ile ilacın kontrollü ve hedefli iletimi mümkün hale getirilmeye başlanmıştır. Ayrıca, kanser hücrelerinde fazla eksprese olan genlerin ve ürünlerinin bilinmesiyle bu genlerin terapötik hedef olduğu çalışmalar artmıştır ve bu doğrultuda tümör bölgelerinde fazla eksprese olan genlerin susturulmasına yönelik çalışmalar günümüzde odak noktası olmuştur. Ribonükleik asit (RNA)'yı seçici bir şekilde hedefleyebilen antisens oligonükleotidler ile antisens teknolojisi bu alanda önemli ajanlar sunmaktadır. Bu terapötik ajanlardan biri olan küçük enterferans yapan (si-RNA)'lar ile hedeflenmiş mesajcı RNA (mRNA)'nın parçalanması mümkün hale gelmiştir. Böylece kanser hücresinin gelişimine sebep olan protein susturularak kanser tedavisi gerçekleştirilebilir. İntegrinler, α ve β zincirinden oluşan heterodimerik hücre yüzeyi reseptörleridir ve hücre dışı matrisi hücre iskeletine bağlarlar. Ayrıca tümör hücreleri üzerindeki hücre dışı matris ve integrin reseptörleri arasındaki etkileşimlerin, hücre göçü ve proliferasyonu gibi tümör hücresi süreçlerinde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. Özellikle, integrin α10 proteinini ifade eden ITGA10 geninin yüksek ifadesi, glioma hastalarında daha kötü bir genel hayatta kalma olasılığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Biz de çalışmamızda, biyouyumlu, biyobozunur ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından insanlar üzerinde kullanımına onay alınmış bir polimer olduğu için Poli (D,L-laktid-ko-glikolid) (PLGA) nanopartikülleri ile glioblastoma hücrelerine terapötik madde olan integrin α10'u hedefleyen siRNA'nın taşınabilmesini ve sonuçta kanser hücresindeki değişimi incelemeyi amaçladık.Böylece, PLGA nanopartikülleri ile siRNA taşınmasının etkinliği, PLGA nanopartikül aracılı siRNA'nın glioblastoma hücrelerindeki integrin α10'u baskılama etkinliği ve integrin α10'un baskılanması ile kanser hücrelerindeki değişikliğin incelenerek PLGA nanopartikülleri ile taşınan siRNA'nın glioblastoma hücrelerindeki integrin α10'u hedeflenmesiyle glioblastoma kanseri için olası bir terapötik yaklaşım öne sürülebilecektir. Anahtar Kelimeler: gen tedavisi, PLGA, nano taşıyıcı, si-RNA, integrin, glioblastoma kanseri
Alzheimer modeli sıçanlarda kaempferol tedavisinin nöroprotektif ve iyileştirici etkisinin araştırılması
Alzheimer hastalığı dünya genelinde en sık görülen demans çeşididir. Her yıl prevalansı artmaya devam eden bu nörodejeneratif hastalığın bilinen bir tedavisi bulunmamaktadır. Alzheimer hastalığının patolojisini oluşturan ana etmenler senil plaklar, nörofibriler yumaklar ve nöroinflamasyon olarak sıralanabilir. Oksidatif stres bu patolojilerin oluşum ve ilerleme sürecinde yer alan en önemli temel etkenlerden birisidir. Birçok tedavi girişimi hastalığın nöropatojenezini hafifletip kognitif fonksiyonu arttırmayı hedeflemektedir. Bu amaçla birçok bitkisel ürün ve bunların etken maddeleri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır. Kaempferol birçok bitkide sekonder metabolit olarak üretilen anti-inflammatuvar ve antioksidant özelliklere sahip bir flavonoiddir. Kaempferolün oksidatif stresi azaltma yeteneği bu molekülü Alzheimer hastalığı çalışmalarında önemli bir hale getirmektedir. Bu tez çalışmasında öncelikle Alzheimer hastalığını modellemek için Long-Evans cinsi erkek sıçanlara intraserebroventriküler olarak streptozotosin (STZ) enjekte edildi. Oluşturulan bu modele tedavi edici madde olarak bir antinöroenflamatuvar ajan olan kaempferol molekülü intraperitoneal olarak verildi. Tedavi bitiminde davranış deneyleri ve moleküler deneyler yapılarak kaempferolün nöroprotektif etkisini incelendi. Kaempferol morris su labirentinde yapılan öğrenme ve bellek testinde anlamlı bir farklılık göstermezken korkuya bağlı hafızayı ölçen pasif sakınma testinde gruplar arasında anlamlı bir farklılık oluşturmuştur. Bununla birlikte STZ enjeksiyonu PSEN seviyesinde anlamlı bir değişim göstermezken BACE ve fosforile TAU seviyesinde artışa sebep olmuştur. İlginç bir şekilde Kaempherolün moleküler düzeyde anlamlı bir iyileştirici etkisi olmamıştır. Bu sonuçlar kaempferol tedavisinin Alzeimer hastalığının fenotipik özeliklerinden olan hafıza kaybı üzerinde olumlu etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bu nedenle bu çalışma kaempherolün Alzheimer hastalığı tedavisinde aday molekül olabilmesi için iyileştirici etkisinin moleküler temellerinin detaylı olarak incelenmesi açısından ilerleyen çalışmalara yol göstericidir. Anahtar Kelimeler: Alzheimer Hastalığı, kaempferol, STZ, BACE1, p-TAU, PSEN
Polimerizasyonla indüklenmiş kendiliğinden birleşme (PISA) yöntemi ile tümör hedefli polimerik misellerin hazırlanması ve karakterizasyonu
Polimerik ilaç taşıyıcı sistemler ilaçların geleneksel kullanımına alternatif olarak dikkat çekmektedir. Özellikle polimerik miseller küçük partikül büyüklüğü, yapısal stabilite, yüksek ilaç yükleme kapasitesi, suda çözünürlük, düşük toksisite gibi özelliklere sahip olduğu için yaygın olarak çalışılmaktadır. Stabilite ya da işlevselleştirme için elverişli olan miseller hedefleme özelliğine sahip ilaç taşyıcı sistemler için idealdir. Miseller hidrofilik ve hidrofobik monomerlerle sentezlenen amfifilik blok kopolimerlerin kendiliğinden birleşmesi sonucu elde edilir. Kopolimer, bloklardan biri için seçici çözücü içerisinde agregat oluşturur. Bu oluşum kendiliğinden birleşmeyi meydana getirir. Polimerlerin alışılmış yöntemlerle kendiliğinden birleşmesi, oluşacak polimerik morfolojileri genellikle sınırlayan seyreltik çözelti (<%1) içinde gerçekleştirilir. Etkili bir yöntem olarak polimerizasyonla indüklenmiş kendiliğinden birleşme (PISA) ise bu sınırlamayı ortadan kaldırır. PISA metodunda başlatıcı polimer için seçici bir çözücü içerisinde dağılan ya da çözünen monomerden çözünmeyen bloğun polimerize edilmesine dayanır. Zincir uzaması başlayan çözünmeyen bloğun polimerizasyon derecesi kendiliğinden birleşme sürecini kontrol eder. Kendiliğinden birleşme ve yeniden düzenlenmeler ile küreler, çubuklar, veziküller, lamel yapılar gibi çok çeşitli morfolojide polimerik yapılar oluşum sürecine gözlenir. Bu çalışmada tersinir katılma-ayrışma zincir transfer (RAFT) polimerizasyonu ile hidroksietil metakrilat (HEMA) ve glisidil metakrilat (GMA) monomerleri kullanılarak hidrofilik bloğu oluşturacak random kopolimerler sentezlenmiştir. HEMA ve fonksiyonlandırılabilir GMA üniteleri farkı oranlarda polimerize edilmiştir. İlk olarak fonksiyonlandırma için polimerler GMA ünitelerinden azitlenmiştir. Ardından propargil ile fonksiyonlandırılan folik asit (FA) azitlenen ünitelere "click" reaksiyonuyla takılmıştır. Elde edilen azit fonksiyonlu makro başlatıcılar (M-CTA) ile hidrofobik bloğu oluşturacak metil metakrilat monomerinin polimerizasyonu RAFT-PISA yöntemi ile sağlanmıştır. Farklı değişkenlere sahip PISA reksiyonları denenmiştir. En stabil sonuç veren parametreler ile aynı yöntem uygulanarak doksorubisin (doks) yüklü miseller hazırlanmıştır. Çalışmada elde edilen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV-Vis ve DSC ile karakterize edilmiştir. PISA ile elde edilen misellerin ortalama partikül boyutları DLS ile ölçülmüştür. Sonuçlar karşılaştırılarak değişkenlerin misel boyutları üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Tiroid fonksiyon bozukluğu olan hastalarda eser element düzeylerinin ve malat dehidrojenaz, izositrat dehidrojenaz, glutamat dehidrojenaz enzim aktivitelerinin araştırılması
Tiroit bir iç salgı bezidir. Hormonlar vücuttaki birçok işlevi salgılar ve düzenler. Bu nedenle hormonların eksikliği veya artması hastanın yaşamında çok ciddi komplike şikayetlere neden olabilir.Tiroit bezi fonksiyonları, genel vücut sağlığı açısından da çok önemlidir. Yapılan araştırmalara göre tiroid hormon seviyesindeki bir dengesizliğin diğer organ ve sistemlerin işleyişini olumsuz etkilediği gözlemlenmiştir. Ayrıca kilo verememe, halsizlik, aşırı kilo verme veya kısa sürede aşırı kilo alma gibi şikayetlerle ortaya çıkan tiroid hormonundaki düzensizliklerin kişinin yaşam kalitesini olumsuz etkilediği bilinmektedir. Başka bir çalışmada dünyada yaklaşık 200 milyon kişinin tiroit hastalığı olduğu ve ülkemizde tiroit hastalıklarının her 10 kişiden 3'ünü etkilediği bilinmektedir. Ayrıca tiroit hastalıklarının kadınlarda daha sık görüldüğü gözlemlenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda Türkiye'de endemik guatr prevalansının %10-30 arasında olduğu Tiroid Hastalıkları Tanı ve Tedavi Rehberi'nin 2019 raporunda bildirilmiştir. Sonuç olarak toplumda tiroit hormonu fonksiyon bozuklukları %5 sıklıkta görülmekte ve sıklığın yaşla birlikte arttığı bilimsel verilerle desteklenmektedir . Hipotiroidizm tedavi edilmezse daha ciddi komplikasyonlara ve hatta hasta için hayati tehlike oluşturan durumlara neden olabilir. Hipotiroidizmin komplikasyonları, düşük metabolizma, kalp hızı, kalp yetmezliği, yaşamı tehdit eden depresyon ve koma gibi hayati risklere neden olarak hastaların komaya girmesine neden olabilir . Tiroid hormonları vücutta bazal metabolizmanın sağlanmasında başlıca rolü oynarlar. Krebs (TCA) siklüsü de vücutta enerji metabolizmasının merkezinde yer almaktadır. Bu açıdan TCA döngüsündeki enzimlerin düşüklüğünün veya yüksekliğinin tiroid fonksiyon bozukluklarıyla ilişkili olabiliceği düşünülmektedir. Ayrıca çinko, bakır gibi eser elementler TCA enzimlerinin ve tiroid hormonlarının çalışmasında kofaktör olarak yer almaktadır. Biz çalışmamızda hipo ve hipertiroidili hasta gruplarında çinko ve bakır düzeylerini ve TCA'nın hız ksıtlayıcı enzimlerinden olan Malat dehidrojenaz, İzositrat dehidrojenaz ve Glutamat dehidrojenaz enzim aktivitelerini ötiroid kontrol grubuyla karşılaştırarak tiroid hastalıklarının tanısında bu parametrelerin yararlı olup olmayacaklarını araştırmayı amaçladık. Anahtar kelimeler: Tiroid Fonksiyon Bozukluğu, bakır, çinko, Malat Dehidrojenaz (MDH), İzositrat Dehidrojenaz (IDH), Glutamat Dehidrojenaz (GLDH),Graves Hastalığı, Haşimato Hastalığı
Generation of plasmid-based eukaryotic model to investigate biology of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein and glycoproteins
RNA viruses are the main cause of many pandemics that shape human history by causing the death of millions of people. The rapid adaptability of RNA viruses, which allows them to circulate for thousands of years, and the increased contact of humans with wild animals can trigger the emergence of virus variants that can cause new pandemics. Virus-like particle studies (VLPs) to elucidate unknown mechanisms in the virus life cycle and pathophysiology of disease are of vital importance in the development of effective antiviral strategies against these viruses that affect human life. The lack of genomic material that can cause virus infection paves the way for these viruses to be studied in BSL-2 laboratories, which are easily accessible to many researchers around the world. In recent years, the World Health Organization (WHO) has published a list of infectious agents that should be primarily investigated. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus (CCHFV) and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viruses, which are also clinically important for our country, are included in this list. From this point of view, in this thesis, various viral protein expression studies have been carried out to develop different VLP systems that can both study the biology and immunology of CCHFV and form the basis of vaccine candidate development studies for SARS-CoV-2. For this purpose, firstly, CCHFV viral proteins were produced in Huh-7 cells via pcDNA 3.1 plasmid, and their expression was confirmed by both post-transcriptional and post-translational analyses. Furthermore, immunological analyzes by in-house ELISA revealed that various viral protein combinations may promote the production of different CCHFV proteins. In addition, a unique ambisense minigenome system has been developed. The inclusion of this system in future VLP studies might result in the generation of a transcription and entry competent VLPs for CCHFV Kelkit 06 strain. Second, four different plasmids carrying multiple expression cassettes in various combinations were constructed to produce four different VLP-based vaccine candidates against SARS-CoV-2 in P. pastoris. In conclusion, the experiments conducted in this thesis have shown expression and detection of immunologically significant viral antigenic proteins of CCHFV and SARS CoV-2, two of the most serious human viral pathogens of our time, in eukaryotic cells. These studies have established a critical infrastructure at our laboratory which will be imperative for future studies. It appears that for generation and demonstration at sufficient quantities and commercially meaningful VLPs from plasmid based expression systems, further optimizations are needed. It should be underlined that to address the questions on the biology and immunology of these viruses through VLP and minigenome approaches, these optimizations such as exhaustive trials with different expression models, optimization of sequences, alternative transfection systems and stable expressions should be undertaken.
Mekanik dayanımları iyileştirilmiş polimerik hidrojel sistemleri
Yumuşak malzemelerin kullanıldığı pek çok alanda jellerin iyi mekanik özelliklere sahip olmaları kritik önem taşımaktadır. Doğal ya da sentetik polimerlerden elde edilen jeller birtakım avantajlara sahip olsalar da fizyolojik sıvılarda çok fazla şişerek genellikle çok kırılgan bir yapıya dönüşmektedirler. Bu tezin amacı, mekanik özellikleri kontrol edilebilir ve geliştirilebilir hidrojel elde edilebilmesi için, ağ yapıda moleküler seviyede bir enerji dağılım mekanizması oluşturmaktır. Bu amaç doğrultusunda hazırlanan bu tez iki bölüm şeklinde tasarlanmış olup ilk kısımda doğal bir polimer olan nişasta, ikinci kısımda ise sentetik Pluronik F127 (PF127) zincirleri kullanılarak hidrojeller hazırlanmış ve literatürde mevcut nişasta ve PF127 esaslı jellerin mekanik dayanımları arttırılmıştır. Tezin ilk bölümünde, sırasıyla lineer ve dallanmış şekilde bağlanan aynı tekrar birimlerine sahip iki homopolimer olan amiloz ve amilopektin zincirlerinden oluşan nişasta kullanılmıştır. Nişasta, yapısında bulunan hidroksil gruplarının varlığından dolayı, hidrojellerin oluşumunu içeren çeşitli uygulamalarda işlevselliğin değiştirilmesi ve geliştirilmesi amacıyla kolaylıkla modifiye edilebilir. Doğrudan çapraz bağlama durumunda, nişasta zincirlerindeki hidroksil gruplarının bir kısmı, iki veya çok işlevli bileşiklerle reaksiyona girmeye duyarlıdır. Nişastayı çapraz bağlamak amacıyla polisakkarit kimyasında en yaygın kullanılan çapraz bağlayıcı olan epiklorohidrin (ECH) kullanılmıştır. ECH üzerindeki epoksi ve halojenür grubu, nişasta yapısındaki hidroksit grubu ile reaksiyona girerek iki polimer zincirini çapraz bağlamaktadır. Bu tezde yüksek amiloz içeriğine sahip nişasta (Hylon VII) - ECH hidrojellerinin viskoelastik özellikleri araştırılmıştır. Reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonuna, nişastanın amiloz oranına ve yapıya başka bir polisakkarit olan Hyaluronik asit (HA) katılımına bağlı olarak jel özelliklerinin değişimi incelenmiştir. Elde edilen malzemeler şişme, viskoelastik ve morfolojik özellikleri açısından değerlendirilmiştir. Elastik ve viskoz modüller, nişasta ve ECH konsantrasyonlarına bağlı olarak artarken, NaOH'ın mol oranının, çapraz bağlama reaksiyonlarında anahtar bir parametre olduğu bulunmuştur. Devamlı basamak-deformasyon testi sırasında düşük amiloz oranı içeren ağ yapının, sol-jel geçişleri sonrası başlangıç mekanik dayanımının yaklaşık %92 ± 4'ünü kaybettiği görülmüştür. Amiloz oranı arttırıldığında ise ağ yapı sol-jel geçişlerinden sonra tamamen orijinal hallerine dönmüştür. Yüksek amiloz oranlı jeller için zamana bağlı relaksasyon testleri gerçekleştirilmiş ve yapısal dinamiklerin, HA'nın daha küçük ve daha kararlı gözenek yapılarıyla birleştirilmesiyle bir miktar bastırıldığı gözlemlenmiştir. Tezin ikinci kısmında, "Poloksamerler" olarak da bilinen ve FDA tarafından insan kullanımı için onaylanan Pluronikler kullanılmıştır. Bu moleküller hidrofilik polietilen oksit (PEO) ve hidrofobik polipropilen oksit (PPO) zincirlerinin PEO-PPO-PEO üçlü blok şeklinde birleştiği yapılardır. Pluroniklerin en önemli özelliği, konsantrasyona bağlı farklı geçiş sıcaklıklarında ısıya duyarlı misel oluşturmalarıdır. Yüksek konsantrasyonlarda, sol-jel geçişi oda sıcaklığının altında gerçekleşir. Bu nedenle, polimer oda sıcaklığında su içinde çözüldüğünde, PPO'nun hidrofobik doğası nedeniyle miseller kendiliğinden birleşir. Pluronik çözeltileri düşük sıcaklıklarda sıvı halde iken, belirli sıcaklık değerlerinin üzerine çıktıklarında jel formuna geçmekte ve soğutulduğunda tekrar sıvı hale gelmektedir. Pluronik ailesi içerisinde, medikal ve farmasötik uygulamalarda en çok tercih edilen üye, yüksek suda çözünürlüğü ve nispeten uzun hidrofobik birimleri sayesinde yüksek hidrofobik etkileşimlere sahip Pluronik® F127 (PF127)'dir. Pluronik kopolimerler, belli bir sıcaklıkta çok hızlı bir şekilde sıvı halden jel formuna geçseler de oluşan hidrojellerin mekanik dayanımlarının yetersiz olması nedeniyle fizyolojik koşullarda uzun süre dayanamazlar. Bu durum Pluronik temelli sistemlerin en önemli dezavantajlarından biridir. Hem mekanik olarak güçlü hem de enjekte edilebilir jeller elde etmek için sıcaklığa duyarlı PF127 miselleri, ışığa duyarlı kumarin ve azobenzen gruplarını tekrar eden birimler olarak taşıyan amfifilik kopolimerlerle birleştirilmiştir. Böylece sıcaklığa duyarlı PF127 esaslı akıllı jellerin mekanik dayanımlarının iyileştirilmesinin yanı sıra ışık duyarlılığına sahip enjekte edilebilir yapıların elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla toplamda dört monomer sentezlenmiş ve tersinir katılma-ayrılma zincir transfer (RAFT) polimerizasyonu yoluyla polimerize edilmiştir. Sentezlenmiş olan polietilen glikol (PEG) bazlı makroRAFT ajanı kullanılarak amfifilik diblok terpolimerler elde edilmiştir. Kopolimerlerin yapıları, karakterize edilmiş ve amfifilik diblok terpolimerler, suda miseller halinde bir araya getirilmişlerdir. UV ışık altında kromofor grupların varlığına bağlı misel çekirdeklerinin çapraz bağlanması UV spektroskopisi ile incelenmiştir. Jellerin reolojik özellikleri sıcaklık, bileşim, UV maruz kalma süresi, gerinim ve frekansın bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiş enjekte edilebilirlikleri analiz edilmiştir. Hazırlanan formülasyonların hem ısıya hem de ışığa cevap verdiği, PF127 yapılarına kıyasla mekanik özelliklerinin iyileştiği ve enjekte edilebilir olduğu ortaya konmuştur. Son aşamada ise sisteme fonksiyonlandırılmış kitosan (f-kitosan) dahil edilmesiyle gözenekler arttırılarak ilaç taşıma uygulamalarında kullanılmaya yönelik ilk adımlar atılmıştır.
Nanoparçacık yüklü hidrojeller
Dokuların veya organların polimer bazlı bir malzeme ile desteklenmesinde veya değiştirilmesinde biyofonksiyonellik ve biyouyumluluk önemlidir. Yüksek su içeriğine sahip, çapraz bağlı hidrofilik polimer zincirlerinden oluşan hidrojeller, son yıllarda klasik malzemelerden, uyaranlara duyarlı akıllı malzemelere dönüşmüşlerdir. Akıllı jeller tasarlamak üzere yola çıkılan bu tezin ilk kısmında stearil metakrilat (SM) ve vinilpirolidon (VP) bazlı, kendini iyileştiren ve şekil hafıza özelliklerine sahip biyouyumlu SM-x ağları hazırlandı. Çeşitli potansiyel biyouygulamalardaki gereksinimleri karşılayan jeller elde etmek için mol oranları kademeli olarak hidrofilikten hidrofobik birimlere %10 ila %90 arasında değiştirildi. Elde edilen jellerin zamana bağlı bir viskoelastik karaktere sahip olmalarının yanı sıra, jellerin mekanik özellikleri, reaksiyon ortamına verilen SM miktarı ile kontrol edildi. Düşük SM içerikli jeller başlangıç modül değerlerine tam olarak geri dönemezken, ≥%60 konsantrasyonlarda elde edilen jellerin kendini iyileştirme davranışında da etkili olan dinamik hidrofobik etkileşimler nedeniyle tamamen geri dönüşümlü olduğu gözlendi. Ayrıca tüm ağlar kalıcı şekillerini saniyeler içinde tamamen geri çağırarak şekil hafıza özelliğine sahip olduğu ortaya konulmuş oldu. Suyla temas açısı ile yakından ilişkili olarak SM-x hidrojelleri üzerine ekilen insan derisi fibroblast hücrelerinin canlılığının, tüm x değerlerinde %82'nin üzerinde olduğu bulundu. Bulgular neticesinde, SM-x jel numunelerinin geniş özellik yelpazesi, çeşitli biyomedikal uygulamalardaki ihtiyaçları karşılamak üzere önemli bir potansiyele sahip olduğu ortaya kondu. Tezin ikinci kısmında ise farklı geometrilerde ve yapılardaki metalik nanoparçacıkların özellikleri optimize edilen SM-x hidrojel ağlarına dahil edilmesiyle nanokompozit hidrojeller geliştirildi. Bu durum tamamen farklı iki malzeme türünün yenilikçi bir kombinasyonu ve yapısal bir çeşitliliğidir. Nanoparçacıkların daha az aglomare olması, mekanik güç ve uyaranlar karşısında sinerjistik özellik göstermesi sayesinde ileri fonksiyonel gelişmiş malzemeler oluşturuldu. Sıcaklığa duyarlı SM-VP hidrojellerinin ağ yapılarına akıllı malzeme özelliklerinin arttırılması için altın nanoküre (AuNS) ve gümüş nanoküp (AgNC) parçacıkları farklı oranlarda dahil edildi. Elde edilen nanokompozitler jellerin (Nc) nanoparçacıklar varlığında fototermal etkiye etkiye sahiptirler. Bu özellik Nc'ler hem ışığa hem de ısıya duyarlı jeller haline getirildi. Sentezlenen Nc jeller uygulanacak alana özgü testlerle farklı özellikler sergiledi. Örneğin, ışık kaynağı altında kendini iyileştirme özelliği AgNc 0.08 jellerinde en iyi sonucu verirken, şekil hafıza özelliği açısından AgNc-0.02 jellerinde sonuç belirgin bir farklılık gösterdi. Matriks içindeki nanoparçacıklar sayesinde SM-x versiyonuna kıyasla sıcaklık altında AgNc-0.08 jelleri kendini iyileştirme özelliği gösterirken, AgNc-0.02 jelleri ise şekil hafıza özellikleri açısından belirgin bir farklılık gösterdi. Nc-x hidrojelleri üzerine ekilen insan derisi fibroblast hücrelerinin canlılığı, tüm x değerlerinde %80'in üzerinde olduğu bulundu. Bu tez kapsamında nanoparçacık yüklü hidrojellerin, uyaranlar karşısında değişimler göstererek teknolojide yumuşak robotiklerden 4D sistemlere, biyomalzemelerden tıbba kadar çeşitli alanlarda uygulamalar için potansiyel adaylar olabileceği gösterildi.
İyileştirilmiş özelliklere sahip nişasta temelli nanokompozit hidrojeller
Doğal polimerler biyouyumluluğu, biyobozunurlukları, toksik olmaması gibi birçok özelliği sebebiyle özellikle biyomedikal uygulamalarda kullanılmak üzere hidrojel sentezinde tercih edilmektedir. Bu tez kapsamında hidrojel sentezinde en çok kullanılan doğal polimerlerden biri olan nişastanın avantajlarından faydalanarak uygulama alanını genişletmek amacıyla özgün nişasta jelleri hazırlamaya karar verildi. Amiloz/Amilopektin oranının nişasta jelleri üzerindeki bilinen etkisi dikkate alınarak çalışmalar için yüksek Amiloz içeren nişasta Hylon VII kullanıldı. Ancak birçok doğal polimerle hazırlanan hidrojelde olduğu gibi nişastadan elde edilen hidrojellerinde en büyük dezavantajı mekanik dayanıksızlığıdır. Kırılma, bükülme, katlanma gerektiren uygulamalarda bu kırılgan hidrojeller gereksinimleri tam olarak karşılayamamaktadır. Tez kapsamında nişasta hidrojellerinin mekanik dayanımını iyileştirmek amacıyla ağ yapıda enerji dağılımını moleküler seviyede sağlayan bir mekanizma oluşturulması ve böylelikle viskoelastik dağılımın arttırılması için iki yöntem kullanıldı. İlk olarak bir nano yapı birimi olan epoksi gruplarıyla fonksiyonlandırılmış 8 kollu kübik glisidil-Polihedral Oligomerik Silseskioksan (g-POSS) nişastanın çapraz bağlanması için kullanıldı ve özgün tek ağ yapılı nanokompozit bir jel elde edildi. İkinci olarak tek ağ yapı varlığında 2 farklı monomer ile ikinci bir ağ yapı oluşturularak çift ağ yöntemi kullanıldı. Elde edilen nanokompozit nişasta jellerinin karakterizasyon çalışmaları jel fraksiyonu, şişme ölçümleri, temas açısı, SEM analizi, reolojik analizler ve tek eksenli basma-çekme ölçümleriyle ayrıntılı olarak incelendi. Mekanik dayanımı iyileşmiş jeller için çalışmanın son aşamasında protein salım uygulamalarında kullanılmak üzere in vitro salım ortamı oluşturuldu. Hidrojellerin enzim gibi uyaranlara yanıt verebilmesi protein salımını kontrol etmek ve hedeflendirmek için önemli bir özelliktir. Bu doğrultuda nişastanın katalizini sağlayan a-amilaz varlığında jellerin bozunması sağlandı ve a-amilaz yokluğunda aynı salım ortamı sağlanarak protein salım kinetiği kıyaslandı. Gelecek çalışmalar için a-amilaz enzimine duyarlı mekanik dayanımı iyileşmiş jeller, protein veya ilaç salım sistemlerinde potansiyel ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılması bakımından umut vaad etmektedir.
Fibrinolitik enzim olan nattokinaz'ın Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması
Dünyadaki ölümlerin büyük bir kısmı trombotik hastalık kaynaklıdır. Trombotik hastalıklar, kan hastalığı olarak bilinse de günümüzdeki yaygın birçok hastalığın sebebi olabilir; bunların içinde en ciddi ve ölüme sebep veren hastalıklardan biri de kardiyovasküler hastalıklardır. Bu hastalıkların tedavisi için uzun yıllardır antikoagülan ve antiplatelet ilaçlar kullanılmaktadır, ancak bu ilaçlar trombozu çözmede yeterli etki göstermemektedirler. Fakat fibrinolitik enzimler, kan damarı içindeki fibrin pıhtısını parçalama ve pıhtı üzerinde hareket etme yeteneğine sahiptirler. Bu nedenle fibrinolitik enzimler, kardiyovasküler hastalıklar başta olmak üzere birçok trombotik hastalığın tedavisinde büyük önem taşımaktadır. Nattokinaz adlı bir fibrinolitik enzim, Bacillus subtilis natto'nun aprN geni tarafından kodlanır. Nattokinaz, soya fasulyesi ürünü natto'nun fermantasyonu sırasında Bacillus subtilis tarafından üretilir. Nattokinaz, trombolitik ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan ve ileri çalışmalar için umut vadeden bir enzimdir. Nattokinaz, antitrombotik, antihipertansif, antikoagülan, anti-aterosklerotik ve nöroprotektif etkilere sahiptir. Ayrıca nattokinaz, birçok ülkede "nutrasötik" olan doğal bir üründür. Oral uygulamaya uygun olup kanıtlanmış bir güvenlik profiline sahiptir, kullanımı ucuzdur ve diğer farmasötik ürünlere göre birçok avantaj sağlamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda Nattokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmiştir. Bu çalışma literatürde bir ilk niteliğindedir. A. oryzae, kolay kültüre edilebilme, optimize edilebilme, hızlı büyüme, güçlü protein salgılama yeteneklerine sahiptir. Ayrıca A. oryzae, yüksek verimli, güvenli ve düşük maliyetli olması nedeniyle bu çalışma için seçilmiştir. Son zamanlarda, enzim üretiminde konak hücre olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bunun sebebi ise A. oryzae'nin amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretebilme yeteneğidir. Bu yetenek sayesinde A. oryzae, homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu çalışmada Nattokinaz geni, C-Terminaline 8xHis-tag etiketlenerek, Aspergillus kodon optimizasyonuna uyarlanmış ve Amilaz genine füzyon edilmiş şekilde GenScript tarafından sentezlenmiştir. Ardından kalsiyum klorür yöntemi ile kompetent bakteriye (Escherichia coli One Shot) transforme edilmiştir. Ampisilin dirençli LB besiyerinden koloni seçilerek plazmit izolasyonu yapılmıştır. Plazmit, restriksiyon enzimleriyle doğrusal hale getirilmiş ve Agaroz Jel Elektroforezi yapılmıştır. Jelden hedef DNA tespit edilerek ve izolasyonu yapılarak A. oryzae'e transformasyonu gerçekleştirilmiştir (Protoplast Aracılı Transformasyon). Örnekler CD Agar plakalarına ekilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilmiştir. Koloniler SDS-PAGE'de kontrol edilmiştir. Seçilen koloniler DPY besiyerinde kültür edilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilerek ekspresyonları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ekspresyonu tamamlanan proteinlerin saflaştırılması için IMAC metodu kullanılmıştır. Ekspresyon kontrolü ve protein analizi için SDS-PAGE ve ardından Western Blot yapılarak protein saptanmıştır. Yapılan Western Blot sonucunda, Nattokinaz enziminin füzyon şekilde üretimi ve saflaştırılmasının başarıyla gerçekleştirildiği görülmüştür. Çalışma sonucunda 106.66 mg/L NTK enzimi üretilmiştir. İki adet aktivite testi yapılmıştır. Protrombin zamanı testinde, NTK'nın pıhtılaşmayı yaklaşık 8sn yavaşlattığı, pıhtılaşma yüzdesini ciddi oranda düşürdüğü ve INR sonucunda pıhtılaşmayı ciddi oranda yavaşlattığı görülmüştür. Yapılan diğer aktivite testi ise titanyum tüplerde kandan elde edilmiş fibrin parçalarının enzim olan mikrosantrifüj tüplerine aktarılması ve parçalanmanın olup olmadığını gözlemlemek esasına dayanır. Gözlem sonucunda 5-7 gün içinde fibrinin tamamen parçalandığı görülmüştür. Yapılan aktivite testleri sonucunda NTK'nın biokatif bir enzim olduğu kanıtlanmıştır. Anahtar kelimeler: Aspergillus oryzae, Fibrinolitik enzim, Nattokinaz, Protein saflaştırma, Protein üretimi, Transformasyon
Fibrinolitik lumbrokinaz enziminin filamentli mantar Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması
Bu çalışmada lumbrokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de yüksek verimde üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmektedir. Bu enzim fibrinolitik etkiye sahip olduğundan dolayı birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Homolog üretim kaynağı lumbrokinaz için Lumbricus bimastus (283 aa)'dır. Homolog olarak üretimlerinin kısıtlı, zaman alıcı ve pahalı olması sebebiyle araştırmacılar bu enzimin heterolog çalışmalarına yönelmiştir. Fakat farklı ekspresyon sistemlerinde üretilme çalışmalarına rağmen yeterli ve istenilen verimde üretimi sağlanamamıştır. A. oryzae, amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretme yeteneğine sahiptir. Bu özellik sayesinde A. oryzae homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. A. oryzae'nin güçlü protein salgılama, hızlı büyüme, kolay kültüre ve optimize edilebilme özelliklerinden dolayı bu çalışmada ekspresyon sistemi olarak seçilmiştir. C-terminaline 6X His-tag etiketlenmiş ve Aspergillus oryzae'ye kodon optimize şekilde tasarlanmış lumbrokinaz enzimi, pUC19 plazmid vektörüne ligasyon yapılarak sentezlettirilecektir. Gelen vektörün önce Escherichia coli TOP10 hücrelerine transformasyonu, daha sonra protoplast yöntemi ile A. oryzae'ye transformasyonu yapılacaktır. Daha sonra, CD Agar plaklarına ekimi yapılarak koloni seçilecek ve seçilen koloniler daha spesifik koloniler ve protein salınımları için DPY besiyerine ekilecektir. SDS PAGE ile kontroller sağlanacak ve bir koloni seçilerek ekspresyon başlatılacaktır. Proteinlerin saflaştırılması için IMAC (İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi) metodu kullanılacaktır.
Kurkumin yüklü PLGA-DSPE hibrit nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve in vitro etkinliğinin incelenmesi
Poly (D, L Lactic-co-Glycolic acid) (PLGA) biyouyumlu, biyobozunur ve FDA onaylı bir biyopolimerdir. Bu polimer, emülsiyon- solvent evaporasyon yöntemi ile nano miseller hazırlanmasının kolay olması ayrıca, hidrofobik ilaçların taşınması için elverişli olması ile diğer biyouyumlu polimerlerden ayrılmaktadır. Kurkumin ise, Curcuma longa rizomlarından izole edilen, çok sayıda önemli biyolojik aktiviteye sahip bir doğal bileşiktir. Bu biyoaktivitelerin arasında ilk olarak kanser hücrelerinin kurkumin etkisiyle proliferasyonunun inhibe edilmesi ve apoptoza yönelmesi gelmektedir. Buna ek olarak kurkuminin kemoterapi ilaçlarının indüklediği direnç ile ilişkili genlerin aktivasyonunu ve proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Bu proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürmek, kanser hücrelerinde ortaya çıkan kemoterapi direncinin gelişmesini engellemeyi ve kemoterapi ilacının daha etkili hale gelmesini sağlamaktadır. Daha önce laboratuvarımızda yapılan PLGA nano-misellerine 125 g/mL kurkumin yüklemiş ve uygulandığı kanser hücrelerinde NF-κB seviyelerindeki değişim incelemiştir. Bu çalışmanın sonucunda kurkumin'in NF-κB seviyesini düşürmekte başarılı olduğu ancak PLGA nano-misellerinin bu proteinin tüm alt birimlerini etkin şekilde düşürmek için gerekli olan konsantrasyona ulaşamadığı fark edilmiştir. Bu sorun iki sebepten kaynaklanmış olabilir. Kurkumin NF-κB'nin tüm alt birimlerinin seviyesini düşüremeyen bir bileşiktir veya PLGA'nın taşıdığı kurkumin miktarı bu etkinliği elde etmek yetersizkalmaktadır. Bu tez çalışması ile amacımız, PLGA'nın kurkumin taşımak için sahip olduğu hidrofobik kapasiteyi yine biyouyumlu ve FDA onaylı bir fosfolipit olan DSPE ile arttırmaktır. Bunun için "Emülsifikasyon- Solvent Evaporasyon" ve "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" olmak üzere iki farklı yöntem ile PLGA-DSPE hibrit nano-miselleri hazırlandı, hesaplamalı moleküler modelleme yöntemleri ile polimer ve lipidin uyumu incelenmiş ve fizikokimyasal olarak karakterizasyonu tamamlandı. Ardından kurkumin taşımak için hidrofobik kapasitesi geliştirilen PLGA'nın bir kemoterapi ajanı olan 5 – Flourourasil (5-FU) kullanıldığında biyolojik etki açısından iyileşme davranışları in vitro olarak incelenmiştir. "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" yöntemi ile hazırlanan nanomiseller ile taşınan kurkumin miktarının 250 g/mL'ye kadar yükseldiği başarılı bir şekilde gösterilmiştir. Kurkumin yüklü nano-misellerin fizikokimyasal karakterizasyonu Dynamic Light Scattering (DLS) FT-IR, Differential Scanning Chalorimetry (DSC) ve HPLC ile gerçekleştirilmiştir. DLS yöntemi ile boyutu 120 nm (sayıca %) olarak tespit edilen nano-misellerde DSC ve FT-IR yöntemleri ile kurkumin'in başarılı bir şekilde nano-partikülün çekirdek kısmına yerleştiği ve DSPE'nin PLGA'nın tüm fonksiyonel grupları ile etkileştiği tespit edilmiştir. HPLC yöntemi ile oluşturulan hibrit nano-miselin içinde tuzağa düşürülen kurkumin miktarının yüzde enkapsülasyon etkinliği (%EE) %92,006 ve yükleme kapasitesi (%DL) %7,301 olarak ölçülmüştür. Kurkumin'in hibrit nano-miselden salım mekanizması incelenmiş ve Korsmeyer–Peppas modelinin en uygun model olduğu tespit edilmiştir. Buna göre kurkumin'in hibrit nano-misellerden salımının nano-taşıyıcının şişmesine bağlı olarak, difüzyon ile gerçekleştiği ortaya çıkmıştır. Elde edilen optimize formülasyonun stabilitesi yukarıda bahsedilen analiz yöntemleri ile, çeşitli ortam (oda sıcaklığı, liyoflizasyon sonrası ve besiyerinde) ve çeşitli sürelerde incelenmiş ve hazırlanan formülasyonun yüksek ölçekte üretim sırasında pazarlamaya uygun olduğu tespit edilmiştir. Tüm bunlarla birlikte kurkumin yüklü DSPE-PLGA hibrit nano-miselleri için hesaplamalı moleküler modelleme çalışmaları (kuantum kimyasal küme modelleri ve periyodik DFTB+ hesaplamaları) gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak oluşturulan PLGA, DSPE ve kurkumin matriksinde kurkumin'in sadece DSPE veya PLGA ile değil, her ikisi ile etkileşimde olduğu, DSPE'nin PLGA zincirlerini bir arada tutmakta büyük etkisi olduğu ve üçlü sistemin birlikte oldukça kararlı bir sistem ortaya çıkardığı tespit edilmiştir. Bu sonuç stabilite çalışmaları ile uyumludur. Son olarak 250 mg/mL kurkumin taşıyan optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin in vitro biyolojik etkisi LoVo insan kolorektal kanser hücre hattı ve sağlıklı kolon hücre hattı CCD-1072Sk üzerinde incelenmiştir. Bunun için öncelikle 5-FU'nun IC50 değeri 440.9 M olarak hesaplanmış ve ilerleyen deneylerde 5-FU'nun bu konsantrasyonu kurkumin yüklü optimize hibrit nano-miseller ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Optimize formülasyonun kanser hücreleri üzerindeki apoptoz etkisi akridin turuncusu (AO)/ etidyum bromür (EB) çift boyaması, DAPI boyama, floresan mikroskop incelemesi ve akış sitometrisi cihazında Annexin V-FITC ve PI boyama ile gerçekleştirilmiş ve optimize formülasyonun apoptoz üzerindeki etkisi serbest kurkumin'e kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bunu takiben Western Blot yöntemi ile apoptotik protein artışı incelenmiştir. P53 proteininin, NP ile 5-FU kombinasyon uygulaması sonucu oluşan protein ekspresyon düzeylerinin yalnızca NP uygulamasına kıyasla anlamlı düzeyde yüksek olduğu sonucu elde edilmiştir. Bununla uyumlu olarak kemoterapi ve hibrit nano-taşıyıcının taşıdığı kurkumin'in kombine kullanımında hücre içi rekatif oksijen türleri (ROS) oranlarında anlamlı artış gözlenmiştir. Son olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin kurkumin'in hücre içine girişindeki etkisi incelenmiştir. Sonuç olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-miselinin PLGA'nın kurkumin taşıma kapasitesinin başarılı bir şekilde iki katına çıkardığı tespit edilmiş ve 5-FU ile kombine tedavide kemoterapinin etkinliğini arttırdığı tespit edilmiştir. In vivo çalışmalar ile hazırlanan optimize hibrit nano-formülasyonun etkinliğini incelemek araştırmanın bir sonraki basamağı olarak tasarlanmıştır.
Kanser hücre membranı kaplı manyetik nanoparçacıkların sentezlenmesi ve glioblastoma tedavisinde sitotoksik etkinliğinin incelenmesi
Glioblastoma (GBM), yetişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül primer beyin kanseridir. GBM için etkili ilaç dağıtımı, zayıf fizikokimyasal özellikler, terapötik moleküllerin düşük hedefleme yeteneği ve hem kan-beyin bariyerinin (KBB) em de kan-beyin tümör bariyerinin (KBTB) varlığı nedeniyle büyük ölçüde sınırlıdır. Bu nedenle GBM tedavisinde fizyolojik ve patolojik engelleri aşan yeni terapötik platformların geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır. Bilim insanları, nanotaşıyıcı sistemlerin biyouyumluluğunu ve aktif hedefleme yeteneğini artırmak için hücre membranı (HM) kamuflajı gibi yeni tedavi yaklaşımları geliştirmeye odaklanmaktadır. Hücre membranı nanopartiküllerin kullanımı, geleneksel uygulamalara geniş bir işlevsellik yelpazesi sunmak için etkili bir yaklaşım haline gelmektedir. Hücre membranlarını nanopartikül yapılarla birleştirerek doğal biyomimetik nanoyapılar elde etmek gelişen bir araştırma alanıdır. Hücre membranlarının nanopartiküller üzerine kaplanması etkili bir biyo-arayüz sağlamaktadır. Bu nanotaşıyıcıların karmaşık biyolojik aktiviteleri doğrudan kopyalayan yüzeylere sahip olarak tasarlanmasıyla, esas olarak hücre zarından türetilen ve ana hücrenin özelliklerini taklit eden yapıların oluşumu sağlanarak vücutta uzun süreli dolaşım ve aktif hedefleme sağlanabilmektedir. Bu çalışmada sentezlenen biyomimetik nanoplatformun GBM tedavisindeki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. İlk olarak manyetik demir oksit parçacıkları birlikte çöktürme yöntemiyle sentezlenmiştir. Manyetik demir oksit parçacıklarının boyut dağılımı ve zeta potansiyeli dinamik ışık saçılımı (DLS) aracılığıyla analiz edilmiştir. İnsan beyninden izole edilmiş glioblastoma astrositomalarından U87-MG hücre hattından membran fragmentleri izole edilmiş ve zar proteinlerinin tespiti western blot yoluyla gerçekleştirilmiştir. Daha sonra koekstrüzyon yöntemiyle biyomimetik nano platform (Fe3O4@U87HM) birleştirilmiştir. Tersiyer butoksit korumalı lizin metakrilat (tBoc2LzMA), temozolomid metakrilat (TMZMA) ve 2-hidroksi-etil metakrilat (HEMA) ünitelerini içeren kopolimerler RAFT polimerizasyonuyla sentezlenmiştir. Daha sonra tBoc koruma grupları asidik hidroliz reaksiyonu yoluyla uzaklaştırılmıştır. Polimerler 1H NMR, GPC ve FTIR analizleri ile karakterize edilmiştir. Elektrostatik etkileşimlerden yararlanılarak nihai biyomimetik nanoplatform (Fe3O4@U87HM@P) hazırlanmıştır. Biyomimetik nanoplatformların boyutu ve morfolojisi TEM analizi kullanılarak karakterize edilmiştir. Elde edilen nanoplatformun U87-MG glioblastoma kanser hücre ve kontrol hücre hattı olarak CCD-1079Sk sağlıklı insan fibroblast hücre hattına karşı tedavi edici etkisi 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile sitotoksisite açısından değerlendirilmiştir.
Kırım Kongo Kanamalı Ateş virüsü kelkit suşu proteinlerinin ökaryotik hücrelerde stabil ifadesi
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), insanlarda ciddi hastalığa neden olan zoonotik bir bulaşıcı hastalıktır. Bu hastalık özellikle vektör kenelerin endemik olduğu ülkelerde yüksek ölüm oranı ile karakterizedir. KKKAV'nün biyolojisi ve immunolojisine yönelik çalışmalarda viral proteinler diğer viral sistemde olduğu gibi büyük öneme sahiptir. KKKAV proteinlerinin çeşitli süreçlerdeki önemi birçok araştırmalarda ele alınmış ve bu çalışmalarda KKKAV proteinleri genellikle geçici ifade sistemleri kullanılarak üretimi sağlanmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin stabil ifadesi tüm çalışmalar için zaman içerisinde tutarlı ve güvenilir bir model olmaktadır. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, insan hücrelerindeki glikozilasyon süreçlerini taklit edebilen ökaryotik hücre hatları kullanarak KKKAV glikoproteinlerinin ve nükleoproteinlerinin stabil ekspresyon ile sürekli bir şekilde üretilmesini amaçlanmıştır. Bunun için insan hepatoselüler hücre hatları (Huh-7), KKKAV proteinlerinin stabil ifadesinde kullanılmıştır. Hücrelerde seleksiyon için seçici antibiyotiklere olan dirençleri, MTT analizi ile değerlendirilmiştir. KKKAV NP, PreGn ve PreGc kodlayan plazmitler Lipofectamine® 3000 ve polietilenimine (PEI) gibi transfeksiyon ajanlarının yardımıyla hücrelere aktarılmıştır. KKKAV nükleoproteinlerini ve glikoproteinlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, antibiyotiklere dirençli olan kolonilerin seleksiyonu ile üretilmiştir. Hücrelerde transfekte edilen genin stabil ekspresyon için genoma entegrasyonunun tespiti, transfekte edilen KKKAV genlerine özgü primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Genomik düzeydeki doğrulamaların yanı sıra hücrelerdeki hedef proteinlerin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot, enzim immünoanalizleri ve immunfloresan analizleri ile de test edilmiştir. Yapılan deneyler, KKKAV proteinlerinin stabil hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermiştir. Western blot analizi, stabil hücre hatlarında üretilen proteinlerin beklenen boyutta olduğunu ve antijenitelerini doğrularken, EIA analizi bunların antijenik özellikleri tekrar test edilmiştir. Ayrıca, immunofloresan yöntemle mikroskobik görüntüleme üretilen proteinlerin hücreler içindeki lokalizasyonunu ortaya koymuştur. Özetle, bu tez çalışmasında, stabil hücrelerde KKKAV'nün nükleoprotein ve glikoproteinleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Bu stabil hücre hatlarının, KKKAV 'nün biyolojisi, immunolojisi ve patojenezi üzerine daha detaylı araştırmalarda önemli araçlar olarak hizmet etmesi beklenmektedir; çünkü bu virüs, araştırılması gereken öncelikli patojenlerden biri olarak kabul edilmektedir.
İlaç taşıyıcı sistemler olarak tek-zincir polimer nanopartiküller
Nanoteknolojinin artan cazibesi ile hassas boyut kontrolü ve özel olarak işlevselleştirmeye izin veren nano boyutta nesnelerin üretimi için sentetik teknikler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Bu amaçla, polimer zincirlerinin mimari olarak tanımlanan nanoyapılara çökmesi veya katlanması ile oluşturulan tek-zincir polimer nanopartiküller (SCNP) polimer biliminde son yirmi yılda gelişmekte olan ve günümüzde hızla büyüyen bir araştırma konusudur. Ultra küçük çapraz-bağlı nanopartiküller olan SCNP'ler, yüksek seyreltme koşullarında zincir içi çapraz bağlanma yoluyla lineer polimer zincirlerinin ayrı ayrı katlanması veya çökmesi ile elde edilir. SCNP'ler geleneksel polimer nanopartiküllerden çok daha küçük 1-20 nm boyutunda polimer nanopartiküllerinin oluşumuna olanak sağlar. Son yıllarda bu alana olan ilgi kataliz, sensörler, nanoreaktörler ve biyotıp alanı da dahil olmak üzere SCNP'nin çeşitli potansiyel uygulamaları nedeniyle artmaya devam etmektedir. Özellikle ortaya koydukları çok çeşitli uygulamaların bir sonucu olarak, biyotıp alanında herhangi bir araştırma konusu için umut verici nanotaşıyıcılardandır. SCNP'nin oluşumu için bir dizi sentetik metodoloji kullanılmıştır. Örneklerin çoğu seyreltik polimer çözeltilerinde (tipik olarak <1 mg mL-1) postpolimerizasyon modifikasyon reaksiyonlarını içermektedir. Postpolimerizasyon çapraz bağlama reaksiyonları tipik olarak verimliliklerine göre seçilir; düşük verimli veya yan reaksiyonlar içeren reaksiyonlar istenmez. Zincir içi çapraz bağlama, kovalent, dinamik kovalent ve kovalent olmayan etkileşimler ile oluşur. Bu tez çalışmasında, ilaç taşıyıcı sistemler olarak tek-zincir polimer nanopartiküller ile 3 farklı çalışma gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalarda ilaç molekülleri SCNP oluşumunda zincir içi çapraz bağlanmayı gerçekleştirecek şekilde seçilmiş olup SCNP'lerde herhangi bir ilaç yüklemesine ihtiyaç duyulmayacaktır. İlk olarak sisplatin molekülü çapraz bağlayıcı olarak kullanılarak SCNP'ler oluşturulmuştur. Bunun için tersinir katılma-ayrışma zincir transfer (RAFT) polimerizasyonu ile poli[poli(etilen glikol) metil eter metakrilat-r-metakrilik asit] (P(PEGMA-r-MAA)) hidrofilik kopolimeri ve poli(etilen glikol)-b-poli(N-izopropilakrilamid-r-metakrilik asit) (PEG-b-P(NIPAM-r-MAA)) amfifilik kopolimeri sentezlenmiştir. Aynı zamanda halka açılma polimerizasyonu kullanılarak poli[(γ-benzil-L-glutamat)-r-(Nε-benzilkarbonil-L-lizin)] [P(Glu-r-Liz)] hidrofilik kopolimeri ve poli (etilen glikol amin)-b-poli[(γ-benzil-L-glutamat)-r-(L-alanin)] [PEG-b-P(Glu-r-Ala)] amfifilik kopolimeri sentezlenmiştir. Bu öncü polimerlerin sisplatin molekülü ile ultra seyreltik koşullarda reaksiyonu sonucunda SCNP'ler oluşturulması hedeflenmiştir. Yapılan ikinci çalışmada kurkumin molekülünün çapraz bağlayıcı olarak kullanılmasıyla SCNP'ler oluşturulmuştur. Öncelikle RAFT polimerizasyonu ile poli[poli(etilen glikol metil eter metakrilat)-r-(bromometakrilat)] (P(PEGMA-r-BrMA)) hidrofilik kopolimeri sentezlenmiştir. Ardından kurkumin molekülü ile ultra seyreltik koşullarda reaksiyonu sonucunda SCNP'ler oluşturulmuştur. Son çalışmada ise kurkumin molekülünün çapraz bağlayıcı olarak kullanılmasıyla iribaş yapılı tek zincir polimer nanopartiküler (TSCNP) sentezlenerek miselleri oluşturulmuştur. Öncelikle RAFT polimerizasyonu ile poli(etilen glikol)-b-poli[(metil metakrilat)-r-(metakrilik asit)] (PEG-b-P(MMA-r-MAA)) amfifilik kopolimeri sentezlenmiştir. Ardından kurkumin molekülü ile ultra seyreltik koşullarda reaksiyonu sonucunda TSCNP'ler oluşturulmuştur. Oluşturulan TSCNP'ler kullanılarak diyaliz yöntemi ile doksorubisin yüklü miseller oluşturulmuştur Tez kapsamında elde edilen tüm polimerler, jel geçirgenlik kromatografisi (GPC), nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H NMR), diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) teknikleri ile karakterize edilmiştir. Elde edilen SCNP ve TSCNP'ler ise GPC, DSC, dinamik ışık saçılması (DLS), geçirimli elektron mikroskopisi (TEM) analizleri ile çapraz bağlanmaya bağlı değişen molekül ağırlığı, boyut, camsı geçiş sıcaklığı ve morfolojisi açısından karakterize edilmiştir. İlaç yükleme verimliliği ve salım davranışı ultraviole-görünür ışık absorbsiyon spektroskopisi ve mikroplaka okuyucu ile izlenmiştir. SCNP, TSCNP ve misellerin sitotoksisitesi ve hücresel alımları incelenmiştir. Yapılan çalışmalar tek zincir nanopartiküllerin ilaç taşıyıcı sistemler açısından önemli bir potansiyele sahip olduğunu ve bu doğrultuda umut vadeden araştırmaların gerçekleştirilebileceğini ortaya koymaktadır.
Kurkumin yüklü topikal formülasyonların geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Yaygın şekli ile zerdeçal olarak bilinen Curcuma longa L.; rizomunda bulunan biyoaktif bileşiklere, özellikle Kurkumin'e ve Turmeron'a atfedilen terapötik etkileri ile tanınmaktadır. Bu bileşikler; antienflamatuar, antioksidan ve anti-tümör etkileri dahil olmak üzere çeşitli terapötik özellikler sergilemektedir. Bununla birlikte, bu bileşiklerin topikal olarak uygulanması deri üzerinde irritasyona neden olma konusunda önemli bir potansiyel taşımaktadır. Bu çalışma kapsamında, deride görülen irritasyon olasılığının azaltılmasına yönelik Kurkumin ve Turmeron yüklü katı lipit nanopartiküllerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Katı lipit nanopartikül formülasyonları, yüksek devirli homojenizasyon ve ultrasonikasyon yöntemi kullanılarak hazırlanmış ve yanıt yüzey metodolojisi uygulanarak optimize edilmiştir. Katı lipit Compritol® 888 ATO (gliseril behenat) ve yüzey aktif madde Plantacare® 810 (kapril glukozit) miktarları bağımsız değişkenler, enkapsülasyon etkinliği ve partikül boyutu ise yanıtlar olarak belirlenmiştir. Hazırlanan bütün formülasyonlara belirlenen kritik parametreler öncülünde deneysel tasarım çalışmaları uygulanmıştır. Katı lipit miktarının arttırılması, enkapsülasyon etkinliği değeri üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa yol açmıştır. Yüzey aktif madde miktarının artmasının da enkapsülasyon etkinliğini olumlu yönde etkilediği görülmüştür. Partikül boyutu incelendiğinde ise, Plantacare® 810 miktarındaki değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı bir etki gösterirken Compritol® 888 ATO miktarındaki değişikliklerin boyut üzerinde istatistiksel olarak bir anlamlılık göstermediği görülmüştür. Optimize edilmiş katı lipit nanopartikül formülasyonu, Kurkumin ve Turmeron için yüksek oranda enkapsülasyon etkinliği göstermiştir. Elde edilen nanopartiküllerin küresel ve homojen bir şekle sahip olduğu çevresel taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ile doğrulanmıştır. In-vitro salım çalışması için sink koşulları sağlanmış olup 24 saatlik salım süresinin sonunda Kurkumin ve Turmeron için sırasıyla % 71,32 ± 3,73 ve % 67,23 ± 1,64 oranlarında kümülatif salım elde edilmiştir. İlave olarak, formülasyonun stabilitesi fiziksel stabilite testleri ile doğrulanmış ve formülasyonun 5 ± 3°C'de en az 60 gün boyunca saklanabileceği gösterilmiştir. Özellikle, yeniden yapılandırılmış insan epidermal modeli EpiDerm™ kullanılarak yapılan in-vitro deri irritasyon çalışması neticesinde, enkapsüle edilmemiş Kurkumin ve Turmeron ile karşılaştırıldığında Kurkumin ve Turmeron yüklü katı lipit nanopartikül ile irritasyon düzeyinde önemli bir azalma olduğu ortaya konmuştur. Bu bulgular, irritasyon düzeylerinin azaltılması sayesinde optimize edilmiş katı lipit nanopartikülün Kurkumin'in ve Turmeron'un çeşitli topikal kullanımları için uygun bir taşıyıcı sistemi olduğunu desteklemektedir.
Sıçanlarda paratiroit ve tiroit dokusuna özgü referans gen belirlenmesi
Gen ekspresyon analizleri, moleküler biyoloji ve biyoteknoloji alanlarında genlerin fonksiyonel rollerini transkripsiyonel düzeyde anlamak için en temel ve güçlü yöntemlerden biridir. Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu, bu analizler için yüksek hassasiyeti, hızı ve güvenilirliği sayesinde en sık tercih edilen teknikler arasında yer almaktadır. Ancak, GZ-PZR verilerinin doğruluğu, gen ekspresyon düzeylerini standardize etmek amacıyla kullanılan referans genlerin doğru seçimine ve stabilitesine doğrudan bağlıdır. İdeal bir referans genin, farklı doku tipleri, fizyolojik koşullar ve deneysel gruplar arasında sabit bir ekspresyon seviyesini koruması gerekmektedir. Referans gen seçimindeki hatalar, gen ekspresyon verilerindeki gerçek değişimlerin yanlış yorumlanmasına ve hatalı biyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu çalışmada, tiroit ve paratiroit dokularına özgü genler olan tiroglobulin (TG) ve parathormon (PTH) ekspresyonunun güvenilir bir şekilde normalizasyonu için en uygun referans genlerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Çalışma kapsamında Sprague-Dawley ve Wistar olmak üzere iki farklı sıçan ırkı ve her iki ırka ait erkek ve dişi bireyler kullanılmıştır. Aday referans gen olarak RPLP13A, PGK1, SDHA, TBP, HPRT1, GAPDH, YWHAZ, VCL, ve ACTB genleri seçilmiş ve ekspresyon stabiliteleri dört farklı biyoinformatik algoritma (BestKeeper, NormFinder, GeNorm ve Delta Ct metodu) kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Bu çok yönlü yaklaşım, her bir genin farklı deneysel koşullardaki performansını detaylı bir şekilde değerlendirme imkanı sunmuştur. Elde edilen sonuçlar, referans gen stabilitesinin evrensel bir özellik olmadığını, aksine incelenen biyolojik değişkenlere (ırk ve cinsiyet) bağlı olarak önemli ölçüde farklılıklar gösterdiğini net bir şekilde ortaya koymuştur. RefFinder arayüzü ile yapılan bütüncül sıralama analizleri, bu farklılıkları somutlaştırmaktadır. Seçilen dokuz aday gen içerisinden; PGK1, HPRT1, YWHAZ, VCL genlerine ait Ct değerleri 38'den büyük olması sebebiyle tüm stabilite analizlerinde dışlanmıştır. Erkek sıçanlarda ACTB (geometrik ortalama: 1,68) ve SDHA (geometrik ortalama: 1,86) genleri en yüksek stabiliteye sahip referans genler olarak belirlenirken, dişi sıçanlarda SDHA (geometrik ortalama: 1,19) ve TBP (geometrik ortalama: 2,45) genlerinin daha üstün bir stabilite profili sergilediği görülmüştür. Bu bulgu, cinsiyetin gen ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisinin altını çizmekte ve gen ekspresyon normalizasyonunda bu faktörün göz ardı edilmemesi gerektiğini vurgulamaktadır. Irk bazlı değerlendirmelerde de benzer değişkenlikler saptanmıştır. Sprague-Dawley sıçanlarında TBP ve ACTB genleri stabilite açısından öne çıkarken, Wistar sıçanlarında SDHA ve TBP genleri daha yüksek stabilite değerleri elde etmiştir. Bu durum, referans gen seçiminde türler arası validasyonun gerekliliğini göstermektedir. Ayrıca, geleneksel olarak "housekeeping" gen olarak kabul edilen GAPDH'nin, incelenen tüm deneysel koşullar ve analiz yöntemlerinde en düşük stabiliteyi göstermesi dikkat çekicidir. Bu bulgu, GAPDH gibi yaygın genlerin otomatik olarak referans gen olarak kullanılmasının sonuçları yanlış veya eksik yorumlamaya neden olabileceğini kanıtlamaktadır. Bu çalışmanın sonuçları, GZ-PZR tabanlı gen ekspresyon analizlerinde güvenilirliğin artırılması için referans gen validasyonunun mutlak bir gereklilik olduğunu göstermektedir. Bulgularımız doğrultusunda, Sprague-Dawley ve Wistar sıçanlarının tiroit ve paratiroit dokularındaki gen ekspresyon çalışmalarında, normalizasyon için SDHA ve TBP genlerinin birinci tercih olarak kullanılması önerilmektedir. Ancak, en güvenilir sonuçlar için, çalışmanın spesifik biyolojik koşullarına (örneğin, erkek sıçanlar için ACTB ve SDHA, dişi sıçanlar için SDHA ve TBP) uygun referans gen kombinasyonlarının seçilmesi kritik önem taşımaktadır. Ayrıca, gen ekspresyon verilerinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini en üst düzeye çıkarmak için tek bir analitik yönteme bağlı kalmak yerine, BestKeeper, NormFinder ve GeNorm gibi çoklu algoritmaların birlikte kullanılması tavsiye edilmektedir. Bu çalışmada, tiroit ve paratiroit araştırmaları için daha sağlam bir moleküler profilleme çerçevesi sunmakta ve gelecekte bu dokularda gen ekspresyonu analizleri yapacak araştırmacılar için değerli bir referans oluşturmaktadır.
Hastane ve çevresinin işitsel peyzaj kapsamında değerlendirilmesi:Bir kamu hastanesi örneği
Amaç: Çalışmada işitsel peyzaj yaklaşımı kapsamında hastane ve çevrenin akustik ortamını değerlendirmek amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışma ikinci basamak kamu hastanesi olan Antalya Kepez Devlet Hastanesinde gerçekleştirilmiştir. Hastane iç ve dış ortam seslerinin ölçümleri iki adet "SVANTEK SV971" model gürültü ölçüm cihazı kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada yapılan çevresel gürültü ölçümleri ISO 1996/1 standardına göre yapılmıştır. Ölçüm; yapılan alanın karakteristiğini ölçebilecek ve kapsayacak süreyi de içine alacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Veri toplama aracı olarak ISO/TS 12913–2:2018 ve ISO/TS 12913–3:2019 ölçeğinin; Dökmeci Yörükoğlu ve ark. (2023) tarafından yapılan Türkçe uyarlaması kullanılmıştır. Ses ölçümleri ve anket çalışmaları eş zamanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Gürültü kaynakları ve ölçüm yeri sonuçlarımız değerlendirildiğinde, algılanan en yüksek gürültü kaynağının hastane dışında trafik gürültüsü (%21,2), hastane içinde ise insan sesi (%35,1) olduğu saptanmıştır. Hastane içinde gerçekleştirilen ölçümlerde Laeq değeri 63,61 dbA olarak saptanırken, hastane dışında bu değer 63,44 dbA olarak bulunmuştur Akustik parametrelerle (LAeq, L10, L50 ve L90) ses ortamının genel algısı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Buna rağmen çalışma grubunun ses kaynağı ve ölçüm yerine bağlı algılanan duygusal nitelik puan ortalamaları incelendiğinde hastane içinde ve dışında algılanan duygusal nitelik puan ortalamaları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu bulunmuştur. Yapılan korelasyon analizinde ses ortamının genel algısı ve mevcut sesin hastaneye uygunluğu arasında orta düzeyde pozitif bir ilişki bulunmaktadır. Sonuç: Hastalar ve hasta yakınları, hastane içi ve dışı ses düzeyinin uluslararası standartların üzerinde ve rahatsız edici seviyede olmasına rağmen hastanedeki ses ortamını, hastane ses ortamı ile orta düzeyde uyumlu olarak tanımlamışlardır. Anahtar Kelimeler: işitsel peyzaj, gürültü seviyesi, hastane