Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz tanı kiti kontrol materyalinin geliştirilmesi ve stabilizasyonu

ÖZET Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz (G6PD), eritrositlerin bütünlüğünü korumak ve oksidatif stresi önlemek için nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) üreten pentoz fosfat yolundaki hız kısıtlayıcı enzimdir. G6PD eksikliği, dünyanın birçok bölgesinde olmak üzere 400 milyondan fazla kişiyi etkilemektedir. Ülkemiz genelinde %0,5, Çukurova bölgesinde %8.2 oranında görülmektedir. Hastalara sadece eksikliğin olduğunu söylemek yeterli değildir, çünkü semptomların şiddeti enzim aktivitesinin miktarına bağlıdır. Bu sebeple kantitatif metotlar klinik takip, tedavi ve alınacak önlemler açısından önem taşımaktadır. Üniversitemiz bünyesinde ürettiğimiz G6PD aktivite ölçüm kitinin validasyon aşamalarını tamamladıktan sonra rutin laboratuvarımızda kullanılmaya başlanıldı. Yaptığımız ön çalışmalarda kullanmış olduğumuz likit enzim kontrol materyallerinin merkezler arası transfer sırasında sıcaklık değişiminden etkilenerek aktivite kaybına uğradığı tespit edildi. Rutin laboratuvarlarda gün içinde doğru sonuç verilip verilmediğini kontrol etmek ve analitik hataları belirleyebilmek için kullanılan kontrol materyalleri önemli olduğundan bu soruna odaklanıldı. Çalışmamızda farklı yöntem ve kimyasallar kullanılarak stabilitesi uzun G6PD kontrol materyali geliştirmek hedeflendi. Likit tam kan, likit enzim ve liyofilize kontrol materyalleri üzerine çalışıldı. Likit tam kan kontrol materyali için planladığımız 45°C ve +4°C koşullarında yaptığımız deneyler sonucunda kontrol materyali olarak likit tam kanın kullanılmasının uzun süre depolama ve uzak merkezler arası transport koşullarında bir avantaj sağlamayacağı sonucuna varıldı. Stabilite takiplerinde ACD ve CPDA tüplerinin +4°C saklama koşullarında 6-8 hafta arasında stabil kaldığı görüldü. G6PD enzim aktivitesi çalışmak isteyip hemen çalışamayan ve numunelerin dış merkeze transportunu gerektiren durumlarda ACD ve CPDA içeren tüpler kullanılabilir. Likit enzim kontrol materyali için yaptığımız deneyler ve laboratuvarlar arası çalışmada Glisin ve GlisinTris tamponunda çözülen enzim kontrol materyalleri hedeflenen sürelerde stabil kaldı. Liyofilize kontrol materyalleri, rutin kullanımda uzun süreli depolama ve uzak merkezlere transfer gibi uzun süreli stabilite gerektiren durumlarda avantajlıdır. Çalışmamızda hemolizat örneklerinin liyofilizasyonu üzerine çalışıldı. CPDA solüsyonu ile farklı dilüsyon oranları oluşturularak liyofilize edilen ve CPDA ile oda sıcaklığında çözülen kontrol materyallerinde 1 haftalık stabilite elde edildi. G6PD enzim aktivitesi eksik ve normal olan bireylerden alınacak kan örnekleriyle ayrı ayrı stok hazırlamadan farklı dilüsyonlarla farklı seviyelerde kontrol materyali hazırlanabilir. Çalışmamızda hazırlanan liyofilize kontrol materyalleri deney setlerinden bazıları -20°C ve 4°C'de muhafaza edildi. 2 ay muhafaza edildikten sonra çözülen materyallerin stabilite çalışma verilerinde -20°C koşullarında saklama koşullarının faydalı olacağı görüldü. Aynı zamanda her iki sıcaklık koşullarında da albumin ve gliserol gibi liyoprotektanlar eklenerek stabilitenin arttığı gözlemlendi. Çalışmamızda, G6PD enzimi aktivitesi ölçüm kiti için stabil bir kontrol materyali geliştirilmiştir. Ayrıca tezimiz eritrositlerde çalışılan ve benzeri enzim parametrelerinin kontrol materyallerinin geliştirilmesi konusunda literatüre katkı sağlamıştır. Üniversitemizde üretilen G6PD kiti ve kontrol materyali üretimi konusunda yaptığımız tez çalışmamız yerli ve milli üretimde, laboratuvarlarda dışa bağımlılığı azaltmada önemli bir adım olacak ve ülkemize büyük katkı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: G6PD, tanı kiti, kontrol materyali, otoanalizör