İnsan β-defensin-2 proteininin Pichia pastoris'te rekombinant üretimi

Antimikrobiyal peptitler (AMP) 6-100 aminoasit içeren ve canlılar tarafından üretilebilen genelde katyonik, hidrofobik, lizin ve arjinin aminoasitleri açısından zengin olan kısa peptidlerdir. İnsan beta defensin-2 (hBD-2), düşük molekül ağırlıklı, sistein açısından zengin katyonik özellik içeren, epitel hücrelerinde enfeksiyon durumunda üretimi artan antimikrobiyal bir peptidtir. Pichia pastoris ökaryotik protein üretimi için kullanılabilen yüksek ifade, indüklenebilirlik, ökaryotlara yakın glikolizasyon mekanizması gibi avantajlara sahip ekspresyon sistemidir. Bu tez çalışmasında, FaDu (ATCC® HTB-43™) hücre hattı Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) bakterileri ile indüklenmiş ve RNA izolasyonu yapılmıştır. Bu RNA'lardan cDNA sentezi yapılmış ve özgün primerler kullanılarak hBD-2 polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmıştır. Elde edilen hBD-2'nin önce pGEM-T easy vektörüne alt klonlaması yapılmıştır. Ardından pPICZαA vektörüne klonlaması yapılarak elektroporasyon yöntemi ile P. pastoris X-33 hücrelerine transforme edilmiştir. hBD-2 peptidinin, elde edilen rekombinant P. pastoris'te AOX promotörü kontrolünde 30 ℃'de 96 saat boyunca üretimi agar difüzyon testi, qRT-PCR, SDS-PAGE ve western blotlama yöntemleri kullanılarak izlenmiştir. Sonuçta, hBD-2 peptidinin 30 ℃, 150 rpm'de ve %2 metanol indüklemesi ile 96 saatte üretiminin gerçekleştiği tespit edilmiştir. Elde edilen fonksiyonel özelliklerini koruyan hBD-2 peptidi terapötik amaçlar için kullanılabilir.