76
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0
Araştırmacı
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
Yeni non-steroid anti-inflamatuar ilaç türevlerinin sentezi, karakterizasyonu ve insan glioblastoma hattında anti-kanser potansiyellerinin değerlendirilmesi
Glioblastoma multiforme (GBM) tüm primer beyin kanserlerinin dörtte birini oluşturan ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından grade IV olarak sınıflandırılan ölümcül bir kanserdir. GBM tedavisi günümüzde halen kısıtlı ve hastaların yaşam süresi kısadır. Bu yüzden yeni tedavi yaklaşımlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada NSAİİ (Ibuprofen, Naproksen ve Flurbiprofen) türevlerinın sentezlenmesi ve U-87 MG insan GBM hücre kültüründe yeni sentezlenen bazı NSAİİ türevlerinin in vitro sitolojik etkileri araştırmak amaçlanmıştır. Deneylerde 9 farklı NSAİİ türevi bileşik 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 ve 100 g/ml konsantrasyonlarında U-87 MG insan GBM hücre kültüründe 48 saat süresince denenmiş ve MTT testi ile hücre canlılığı belirlenmiştir. Ardından LDH testi ile membran bütünlüğü araştırılmıştır. Elde edilen değerlere göre NSAİİ türevlerinin U-87 MG insan GBM'de kontrol grubu ile karşılaştırıldığında konsantrasyona bağlı olarak sitotoksik etki gösterdiği bulunmuştur. Yeni sentezlenen NSAİİ türevlerinin U-87 MG insan GBM hücreleri üzerindeki sitotoksik ve anti-kanser etkileri ilk defa bu çalışma ile ortaya konulmuştur.
Fungal biyopreparatların ticari formülasyonlarında kullanılabilecek uv-koruyucu pigment üreten fungusların izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu
Güneş ışığından kaynaklanan ultraviyole radyasyon entomopatojenik fungusların canlılığını etkileyen en önemli faktördür. Mikrobiyal ajanların doğada kalıcılığını arttırmak için yapılan çoğu uygulamada formüle edilen konidilere UV koruyucular ilave edilir. Bu uygulamalara rağmen, birçok durumda formüle edilen konidilerin alan etkinlikleri zararlıların kontrolü için hala tam olarak yeterli değildir. Bu nedenle pigmentler gibi UV koruyucu yeni doğal ürünlerin keşfine ihtiyaç vardır. Bu amaçla Erzurum'da 1800 m ve üzeri rakımda 20 farklı noktadan toprak örnekleri alındı. Laboratuvarda yapılan izolasyonlarda pigment ürettiği tespit edilen 2 filementöz fungus ve 6 maya saflaştırıldı. Yapılan ön seleksiyonda bu pigment üretici funguslar içerisinden sadece A2 ve A3 kodlu maya izolatları pigment ekstrasyonuna yatkın olmasından dolayı seçildi ve pigmentler saflaştırıldı. Ardından bu iki izolata ait pigmet örnekleri 0,5 mg/ml, 1 mg/ml ve 2,5 mg/ml olacak şekilde B. bassiana spor süspansiyonlarına ilave edildi. Pigment ilave edilen süspansiyonlar 15, 30 ve 60 dakika boyunca UV ışınları ile muamele edildi. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda pigment ilavesi bütün denemelerde UV ışınlarına karşı koruma sağlayarak konidi çimlenmesini arttırdı. En iyi sonuçlar A2 izolatına ait pigmentin ilavesi ile elde edildi. PaF04 kodlu B. bassiana izolatı 30 dakikalık UV muamelesi sonucunda konidi çimlenme oranı %39.58'e düşerken, 0,5 mg/ml konsantrasyonunda A2 pigment ilavesi sonucunda bu oran %99.16 olarak kaydedildi. Bu nedenle A2 pigmentinin antimikrobiyal özelliği, antioksidan aktivitesi ve mayanın moleküler karakterizasyonu gerçekleştirldi. Yapılan çalışmaların sonucunda, pigmentin UV koruyucu özelliğinin yanında antioksidan aktivite gösterdiği belirlendi. Ayrıca gram negatif G(-) ve gram pozitif G(+) bakterilere karşı antibakteriyal özellik gösterirken, antifungal aktivite göstermedi. A2 kodlu izolat, yapılan ITS sekans analizi sonucu Sporobolomyces roseus olarak tanımlandı ve KY705066 erişim numarası ile GenBank'a kaydedildi.
İn vitro alzheimer modelinde farklı seskiterpenlerin nöron koruyucu etkilerinin değerlendirilmesi
Alzheimer hastalığı (AH) genel anlamda zihinsel hastalıkların %60'ını kapsamaktadır ve en önemli nörodejeneratif hastalıklardan biridir. Bu çalışmamızda, insan nöroblastom hücre hattı (SH-SY5Y) retinoik asit uygulanarak nöron benzeri hücrelere dönüştürülmüştür. Dönüştürülen hücrelerde Alzheimer ortamını oluşturmak için geniş doz aralıklarında β-amiloid 1-42 proteini (0-200 µM) 24/48 saat uygulanmış ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Ardından, dört farklı seskiterpen (farnesen, gayzulen, östrisin, lökomisin) β-amiloid uygulanmış hücre ortamına geniş dozlarda (0-100 µg/ml) uygulanarak oluşturulan toksisiteye karşı nöron koruyucu etkisi incelenmiştir. İn vitro Alzheimer modelinde hücre canlılık oranlarının tespiti için 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) ve laktat dehidrogenaz (LDH) salınım testleri yapılmıştır. Ardından hücrelerde toksisitenin yol açtığı ölüm türünü belirlemek için Annexin-V/PI incelemesi flov sitometri yöntemi kullanılmıştır. Hücrelerde apoptoz ve çekirdek integritisi, Hoechst 33258 floresan boyama metodu kullanılarak mikroskop altında incelenmiştir. Son olarak, seskiterpenlerin asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi, toplam antioksidan kapasite (TAK) ve toplam oksidatif durum (TOD) seviyeleri üzerine olan etkileri belirlenmiştir. Sonuçlara göre, farklı seskiterpen konsantrasyonlarının β-amiloide karşı koruyucu etkisi hücre canlılık testleriyle gösterilmiş ve seskiterpenlerin hücrelerde gerçekleşen nekroz ölümlerinde önemli ölçüde düşüşe neden olduğu flov sitometri sonuçlarıyla belirlenmiştir. Bunun dışında seskiterpen uygulamalarının AchE aktivitesinde ve TOD seviyesinde azalmaya, ve TAK seviyesinde atışa neden olduğu gözlenmiştir. Bulgularımız, anti-alzheimer potansiyellerine göre test edilen seskiterpen etkinliklerinin uygulama dozuna göre gayzulen>östrisin>farnesen>lökomisin şeklinde sıralandığını ortaya koymuştur.
Metforminin larenks kanseri hücre hattı hep-2 hücreleri üzerindeki etkisinin belirlenmesi ve 5-florourasil ile sinerjistik etkilerinin araştırılması
Larenks kanseri (LKa) en yaygın görülen baş boyun kanseridir ve dünya çapında tüm insan kanserlerinin %1-2,5'ini oluşturur. LKa için yeni tanı ve tedavi yaklaşımları geliştirilmesine rağmen son otuz yılda 5 yıllık sağ kalım oranında önemli bir azalma görülmemiştir. LKa tedavisinde yaygın olarak kullanılan kemoterapötik bir ajan olan 5-FU'nun LKa hastalarının sağ kalım süresine belirgin bir katkısı olmamıştır. Metformin Tip-2 diyabet tedavisinde yaygın olarak kullanılan oral anti-diyabetik bir ilaçtır ve son zamanlarda anti-kanser aktivitesi olduğu birçok kanser çeşidinde gösterilmiştir. Literatürde metforminin farklı kemoterapötik ilaçlarla birlikte alındığında kemoterapötik ilaçların etkinliğini artırabileceği yönünde çeşitli çalışmalar mevcuttur. Ayrıca metforminin insan LKa hücre hattı olan Hep-2 hücreleri üzerinde anti-proliferatif etkileri olabileceğine dair bulgular da mevcuttur. Tez kapsamında metforminin tek başına ve 5-FU ile kombine kullanımının Hep-2 hücreleri üzerindeki etkilerinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda metformin ve 5-FU tek başlarına ve kombine halde hücrelere uygulanmış ve metforminin Hep-2 hücrelerinde apoptozu tetikleyerek hücre çoğalmasını baskıladığı, ayrıca hücre göçünü inhibe ettiği ortaya konulmuştur. 5-FU ile birlikte hücrelere uygulandığında ise hücreler üzerinde sinerjistik olarak apoptozu indüklediği, hücre çoğalması ve göçünü ise inhibe ettiği gösterilmiştir. Beklenmedik bir şekilde, metforminin Hep-2 hücre invazyonunu artırdığı ve 5-FU'nun hücre invazyonunu inhibe edici etkisini ise azalttığı bulunmuştur. Bu bulgular doğrultusunda, metforminin LKa tedavisinde destekleyici ajan olarak kullanılabileceği ilk defa bu çalışma ile ortaya koyulmuştur, ancak, metforminin kanser hücrelerinin invaziv potansiyelini artırma potansiyeli göz ardı edilmemelidir.
Termal kaynaklardan izole elde edilen çeşitli Bacillus türlerinden 1,4-β-endo ksilanaz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve ticari kullanılabilirliğinin araştırılması
Bu çalışmada; Doğu ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde bulunan sıcak su kaynaklarından termofilik bakteriler izole edilmiştir. İzole edilen örneklerin morfolojik özellikleri tespit edilerek total ksilanaz aktiviteleri belirlenmiştir. İzole edilen DNA'lardan 16s rDNA bölgeleri PCR ile amplifiye edildikten sonra klonlanmış ve sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Yüksek aktivite gösteren Bacillus subtilis türüne ait ksilanaz enzimini kodlayan gen dizileri biyoinformatik analiz yöntemleri ile belirlenmiştir. Nikel affinitesi ile 6X-His takısına sahip rekombinant proteinlerin saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan enzim ANADOLUCA yöntemi ile kafeslenmiştir. 5 farklı izolat (Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis ve Geobacillus kaustophilus) tanılanmış olup bunlardan en yüksek aktivite gösteren B. subtilis izolatının ksilanazı saflaştırılarak rekombinant olarak üretilmiştir. Rekombinant ve rekombinant nano ksilanaz enziminin her ikisinin de optimum pH'nın 7.0, optimum sıcaklık değerinin ise rekombinant enzim için 68 °C, nano enzim için ise 75 °C olarak belirlenmiştir. Optimum enzim aktivitesi rekombinant enzim için 1803 U/mg, nano enzim için ise 1898 U/mg olduğu belirlenmiştir. İzolatların Km ve Vmax değerleri rekombinant enzim için sırasıyla 2,298 (mM) ve 5,691 (EU/mL.dk.), Nano enzim için ise 2,402 (mM) ve 6,195 (EU/mL.dk.) olarak belirlenmiştir. Metal iyonlarının rekombinant ksilanaz enzimi için MgSO4 (%80), CuSO4 (%57), CaCl2 (%74), ZnSO4 (%5) ve FeSO4 (%72), rekombinant nano ksilanaz enzimi için ise MgSO4 (%85), CuSO4 (%71), CaCl2 (%85), ZnSO4 (%50) ve FeSO4 (%94) farklı rölatif aktivite gösterdiği belirlenmiştir.
Adi yonca (Medicago sativa L.) ekotip ve çeşitlerinde DNA, protein, çekirdek analizi ve kromozom sayımıyla genetik çeşitliliğin belirlenmesi
Medicago sativa (yonca) çok yıllık, besin değeri yüksek, çevre şartlarına dayanıklı olması nedeniyle ekimi en çok tercih edilen baklagiller familyasına ait yem bitkisidir. Bu çalışmada, bazı yonca ekotip ve çeşitlerinin DNA, protein, çekirdek ve kromozom sayımıyla genetik çeşitliliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, 5 farklı yonca çeşidinin (Medicago sativa cv. Alsancak, Bilensoy, İside, Plato, Bilensoy82) ve 3 farklı ekotip (Erzurum, Muş ve Konya) ve arasındaki genetik uzaklık basit dizi tekrarları (SSR) tekniği ile araştırılmış, elde edilen veriler NTSYS-pc programı ile analize tabi tutulup genetik akrabalık dendrogramı oluşturulmuştur. Erzurum, Muş; Konya, Bilensoy82, Alsancak ve Plato; İside ve Bilensoy arasında akrabalık ilişkiside monomorfik olarak bulunmuştur. M.truncutula olan model organizmamız diğer ekotip ve çeşitlerde akrabalık ilişkisi bulunamamıştır. Kromozom sayıları ise İside, Bilensoy çeşitleri ve Muş ekotipi diploid, Bilensoy82 çeşidi triploid, Konya ve Erzurum ekotipinde kromozom sayısı 30, Plato ve Alsancak çeşidi tetraploid olarak tespit edilmiştir. Toplam protein miktarı ise en yüksek M.truncatula, Konya ve Alsancak en düşük ise Plato, Bilensoy82 ve Muş'da tespit edilmiştir.
Filamentöz funguslardan antibiyofilm aktivitesine sahip ekstrasellüler polipeptitlerin izolasyonu
Mikroorganizmalarda görülmeye başlanan antibiyotiklere direnç, yeni antibiyotik arama çalışmalarını gerekli kılmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik canlıların immün sistemlerinin bir parçası olarak sentezlenen antimikrobiyal proteinler (AMP) yeni nesil antibiyotikler olarak karşımıza çıkmaktadır. AMP molekülleri kısa zincirli, genellikle katyonik ve geniş spektrumlu aminoasit dizileridir. Antibiyofilm proteinler (ABP) ise AMP moleküllerinin bir alt grubu olup, biyofilm oluşumunu engelleyen polipeptit dizileridir. Bu tez çalışmasında, literatürde fungal tabanlı ABP molekülü bulunmadığından, topraktan filamentöz fungus izole edilerek, kültür filtratlarında ABP taraması yapılmıştır. İzole edilen toplam 120 izolat içerisinde agar difüzyon, çapraz ekim, radyal inhibisyon ve tripsin/proteinaz K parçalama yöntemleri ile Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve metisilin dirençli S. aureus'a (MRSA) etkili 2 adet AMP molekülü üreten fungus belirlenmiş ve bu funguslardan 1 tanesinin ABP ürettiği bulunmuştur. İndükleme sistemi ile belirlenen, trikloroasetik asit (TCA) yöntemi ile izole edilen ve ultrafiltrasyon yöntemi ile saflaştırılan antibiyofilm aktiviteye sahip polipeptit, SDS-PAGE ve trisin-PAGE ile doğrulanmıştır. ABP molekülü üreten filamentöz fungusun korunmuş (Internal Transcribed Spacer) ITS ve kalmodülin gen bölgeleri polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve Aspergillus tubingensis olduğu belirlenmiştir. S. aureus'a karşı minimum inhibisyon konsantrasyon (MIC) değeri 32 mg/L, minimum biyofilm inhibisyon konsantrasyon (MBIC) değeri ise 2 mg/L olarak belirlenen ABP molekülü, Maldi-TOF/MS ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon sonrasında bu proteinin UniProt veritabanında kayıtlı, karakterize edilmemiş, A0A1L9MXD7_ASPTU kodlu yeni bir protein olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, filamentöz funguslarda ABP'nin varlığı ilk kez gösterilmiştir. Bu ABP molekülünün, S. aureus'un biyofilm kaynaklı enfeksiyonlarında kullanılabilecek potansiyele sahip olduğu belirlenmiştir.
Serin diyet uygulamalarının deneysel Alzheimer modelinde nöroprotektif etkilerinin değerlendirilmesi
Alzheimer hastalığı (AH), sinaptik işlev bozukluğu ve nörodejenerasyonun eşlik ettiği amiloid-β (Aβ) plakların ve beyinde nörofibriler yumakların birikmesi ile karakterize edilen nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın ilerlemesini yavaşlatacak etkin bir tedavi henüz bulunamamıştır. Bu nedenle deneysel hayvan modelleri kullanılarak yapılan terapötik çalışmalar oldukça önemli hale gelmiştir. Çalışmamızda nöroprotektif etkileri bilinen D-sikloserin ve L-serin aminoasitleri kullanılmıştır. D-sikloserin ve L-serin aminoasitlerinin potansiyel etkileri AlCl3 maruziyeti ile deneysel AH modeli oluşturulan ratlarda davranış testleri ile biyokimyasal, hematolojik ve histopatolojik değerlendirmelerin yanısıra moleküler genetik analizler ile belirlenmiştir. Çalışmada 30 adet dişi Sprague-Dawley rat kullanılarak 6 grup oluşturulmuştur: Grup 1 Kontrol grubu (n=5), Grup 2 AlCl3 uygulaması ile deneysel AH oluşturulan grup (n=5), Grup 3 Tedavi amaçlı D-sikloserin verilen grup (n=5), Grup 4 Tedavi amaçlı L-serin verilen grup (n=5), Grup 5 D-sikloserin grubu (Sadece D-sikloserin n=5), Grup 6 L-serin grubu (Sadece L-serin n=5). AlCl3 maruziyeti ile AH oluşturulan ratlarda oksidatif stres ve nörodejenerasyon görülmüş olup davranış testleri ile de AlCl3 ile oluşturulan deneysel AH modeli doğrulanmıştır. Ayrıca moleküler genetik analizler ile alüminyumun β-sekretaz ve γ-sekretaz aktivitelerini artırırken α-sekretaz aktivitesini azalttığı bulunmuştur. D-sikloserin ve L-serin uygulaması ile alüminyum toksisitesi nedeniyle oluşan nörodejenerasyonda iyileşme sağlanırken oksidatif hasar engellenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen bulguların AlCl3'e bağlı nörodejenerasyon ve bilişsel bozukluğa karşı iyileştirici potansiyele sahip yeni bileşiklerin sentezlenmesine ve ilaç geliştirme araştırmalarına katkı sağlayacağına inanılmaktadır.
Çeşitli bakteri izolatlarının kültür filtratları ve proteinlerinin insan fibroblast hücrelerinde sitotoksik ve moleküler yanıtlarının değerlendirilmesi
Kolorektal kanser, kolon ve rektumun epitel hücrelerinde polip oluşumuyla başlayan bir kanser türüdür. Oluşan polipler pek çok kolorektal kanser için prekürsör olarak kabul edilmektedir. Kolorektal kanser kadınlarda, akciğer ve meme kanserinden sonraki üçüncü, erkelerde ise, akciğer ve prostat kanserinden sonraki dördüncü ölüm sebebini oluşturmaktadır. Hastalığa sebep olabilecek muhtemel risk faktörleri araştırılmış, ancak kolorektal kanser patogenezi ve mikroorganizmalar arasındaki ilişki tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle çalışmamızda öncelikli olarak kolorektal kanserli hastalardan alınan biyopsi örneklerinden bakteri izolasyonları yapılmıştır. Bakterilerin kültür filtratları ile total proteinleri izole edildikten sonra sağlıklı fibroblast hücre hattına olan etkileri; WST-8, hemoliz testi, Kaspaz-3, JC-1 ve Annexin- V analizi yöntemleri ile; gen düzeyindeki değişimleri ise qRT-PCR yöntemi ile analiz edilmiştir. İzolasyonlar sonucunda biyopsi örneklerinden 3 adet Klebsiella pneumoniae, 1 adet Acinetobacter baumannii ve 1 adet Escherichia coli izole edilmiştir. Yapılan analizler sonucunda tüm izolatların kültür filtratları ve proteinlerinin sağlıklı hücreleri özellikle inflamasyon ve nekroz yoluyla ölüme götürdüğü sonucuna varılmıştır. Gen düzeyinde etkileri incelendiğinde ise TP53, SMAD ve APC gibi tümör suppresör genlerin ekpresyonunda azalma, KRAS onkogeninin anlatımında ise kontrole göre artış gözlenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen bulguların, kolorektal kanser tedavisi için mikroorganizma temelli tedavi yaklaşımların geliştirilmesine katkı sağlayacağına inanılmaktadır.
Alkali koşullara ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.) genotiplerinin fizyolojik ve moleküler tepkilerinin belirlenmesi
Buğday tarımı yapılan en eski kültür bitkilerindedir. Bitkiler yaşamları boyunca biyotik ve abiyotik stres koşullarına maruz kalmaktadır. Bu çalışmanın amacı alkali koşullarına Aytın-98, Çetinel-2000 ve Tir ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.) genotiplerinin tepkilerinin hem antioksidant enzim aktiviteleri, element analizi hem de moleküler analizlerle belirlenmesidir. Bu amaçla hidroponik ortam kullanılarak yetiştirilen bitkiler fide döneminde 48 saat süreyle NaHCO3'ün 0, 10, 50 ve 100 mM'lık dozlarına maruz bırakılmıştır. Bu çalışmada kontrolle karşılaştırıldığında hidrojen peroksit (H_2 O_2)süperoksit dismutaz (SOD), peroksidaz (POD) ve katalaz (CAT) aktivitelerinde Çetinel-2000 genotipinde NaHCO3 dozlarının tümünde artışlar olurken Aytın-98 ve Tir geonitplerinde ise artış ve azalışlar meydana gelmiştir. Benzer şekilde malondialdehit içeriği yönünden Çetinel-2000 genotipi yine diğer genotiplerden daha yüksek olmuştur. ISSR (Basit dizi tekrarları arası)'ler ile yapılan Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS) oranları NaHCO3 dozuna bağlı olarak azalma göstermiştir. Strese bağlı olarak DNA hasarları meydana gelmiştir. Element analizi sonuçlarında NaHCO3 dozuna bağlı olarak Na (Sodyum) miktarında tüm genotiplerde artış meydana gelirken K (Potasyum) oranlarında ise azalış olmuştur. Na/K oranlarında da artışlar olmuştur. Çalışmada yapılan analizlere göre Çetinel-2000 genotipinin NaHCO3 ile yapay olarak oluşturulan alkali koşulların tüm dozlarına karşı hassas olduğu diğer taraftan Aytın-98 ve Tir genotiplerinin ise alkali koşullara karşı Çetinel-2000'e göre daha dayanıklı oldukları anlaşılmıştır.
Aspergillus Niger LC3 izolatından antibakteriyel polipeptit izolasyonu
Bakteriler, funguslar, virüsler ve parazitler halihazırda kullanılan en güçlü antibiyotiklere direnç geliştirmiş ya da geliştirmektedirler. Buna paralel olarak günümüzde antimikrobiyal ilaçlara dirençli enfeksiyonlarda artışlar rapor edilmektedir. Bu nedenlerden dolayı yeni antimikrobiyal ajanların keşfi, zorunlu ve aynı zamanda da süreklilik arz etmesi gereken bir durum halini almıştır. Antimikrobiyal ajanlar olarak; çeşitli mikroorganizmaların sekonder metabolitleri ve bazı bitkilerin organik ekstraktları ön plana çıkmaktadır. Ancak, son yıllarda araştırmacılar, mikroorganizmalarla mücadelede; daha spesifik ve daha etkili yeni bir antimikrobiyal grubu olan doğal polipeptitler (AMP'ler) üzerine odaklanmıştır. Bu tez çalışmasında, Aspergillus cinsine ait LC3 izolatından ekstraselüler proteinlerin izolasyonu yapılarak, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve Metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) patojenlerine karşı antimikrobiyal etkinliği test edilmiştir. Antimikrobiyal aktivitenin protein kaynaklı olduğu tripsin/proteinaz K testi ile belirlenmiş ve bu proteinin jel kapatma testi ile 11 kDa'luk bir protein olduğu saptanmıştır. Ardından saflaştırılan bu proteinin S. aureus'a karşı minimum inhibisyon konsantrasyon (MIC) değeri 8 µg/ µl, MRSA'ya karşı ise 32 µg/ µl olarak belirlemiş ve AMP molekülü olduğu doğrulanmıştır. LC3 izolatı yapılan ITS sekans analizi sonucu Aspergillus niger olarak tanımlanmış ve MK332597 erişim numarası ile GenBank'a kaydedilmiştir. Sonuç olarak saflaştırılan AMP molekülünün, S. aureus'dan kaynaklı enfeksiyonlarda kullanılabilecek potansiyele sahip olduğu belirlenmiştir.
Lovastatin üretici fungusların taranması ve moleküler karakterizasyonu
Lovastatin, HMG-CoA'nın mevolanata dönüşümünü katalizleyen HMG-CoA redüktaz enziminin yarışmalı inhibitörüdür, kalp ve damar hastalıkları tedavisinde ilaç olarak kullanılır. Bu tez çalışmasında topraktan izole edilen filamentöz fungusların, lovastatin üretimi yönünden taranması ve moleküler karakterizasyonu amaçlanmıştır. Yapılan izolasyonlarda toprak örneklerinden 52 adet fungus saflaştırılmış ve Candida albicans ile yapılan ön seçim işleminde 14 adet izolat pozitif sonuç vermiştir. Daha sonra bu 14 izolattan lovastatin ekstraksiyonu yapılarak, ekstraktlar saf lovastatinle ince tabaka kromatografisinde karşılaştırılmıştır. Lovastatinle benzer Rf değerine sahip bant veren 5 izolat belirlenmiş ve spektrum taraması yapılarak doğrulanmıştır. Seçilen 5 izolatın moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve GenBank'a kaydedilmiştir. Sonuçta, soya unu eklenmiş sıvı besiyerinde 7 günlük inkübasyon sonucu: Fusarium solani B5B, 20,9 mg/L; F.oxysporum C11, 22,28 mg/L; Penicillium brevicompactum C6, 28,34 mg/L; P.commune C9, 27,59 mg/L; Sarocladium strictum HA4 ise 43,77 mg/L lovastatin üretmiştir. Bu çalışmada lovastatin üretici yeni lokal izolatlar ortaya çıkarılmış olup, en yüksek verime sahip HA4 izolatı lovastatin üretimi için umut vaadetmektedir.
Farklı kaynaklardan izole edilen pigment üreten bakterilerin tanılanması ve tekstil endüstrisinde boyar madde olarak kullanılması
Bu tez kapsamında önceki çalışmalarda izole edilen ve kültür koleksiyonunda bulunan izolatlardan pigment üretenler tespit edilerek klasik ve moleküler yöntemlerle tanılanmıştır. Bakterilerden metanol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak izole edilen pigmentler TLC ve spektrofotometre kullanılarak karakterize edilmiştir. İzole edilen pigmentlerin tekstil endüstrisinde ipek kumaş üzerinde boyar madde olarak kullanımı değerlendirilmiştr. Ayrıca insan sağlığına etkileri; sağlıklı fibroblast hücre hattında MTT testi, eritrosit hücrelerinde ise hemolitik aktivite testi ile belirlenmiştir. Çalışmanın sonucunda ortalama 570 izolattan en iyi pigment oluşturduğu gözlenen 6 izolat belirlenmiş ve bunlardan AS-54, AS-55, AS-67 izolatları Serratia plymuthica AS-75 izolatı Serratia marcescens, AHS izolatı Micrococcus luteus, FAS-TUR izolatı ise Paracoccus marcusii olarak tanılanmıştır. Tanılanan izolatlardan elde edilen pigmentlerin karakterizasyonu sonucunda, AHS ve FAS-TUR izolatlarından elde edilen pigmentlerin literatür verileriyle karşılaştırıldığında beta-karoten, diğer izolatlardan elde edilen pigmentlerin de prodigiosin olduğu belirlenmiştir. Pigmentlerin ipek kumaş boyamada olumlu sonuç verdiği, hücre canlılığı üzerine olan etkilerine bakıldığında ise; hemolitik aktivite göstermediği ve toksik etkisinin bulunmadığı tespit edilmiştir. Bu bağlamda izole edilen pigmentlerin tekstil endüstrisinde çevre-dostu doğal kumaş boyası olarak kullanımının mümkün olabileceği sonucuna varılmıştır.
İminodiasetik asidin In vıtro ve In vıvo anti-alzheimer potansiyelinin değerlendirilmesi
Alzheimer hastalığı (AH), en sık görülen nörodejeneratif hastalıklardan biridir. Dünya genelinde yaşlı insanlardaki bunama olgusunun % 80' inden fazlasını oluşturmaktadır. AH patolojik olarak, hücre içi nörofibriler yumaklar ve hücre dışı amiloid protein birikimleri ile karakterizedir. AH için henüz etkin bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır. Bu nedenle, AH' na karşı önleyici veya yavaşlatıcı terapötiklerin geliştirilmesine yönelik araştırmalar büyük önem taşımaktadır. Mevcut tez çalışmamızda, çeşitli yararlı biyolojik etkileri olduğu bilinen, iminodiasetik asit (IDA) aminoasidinin anti-Alzheimer potansiyeli değerlendirilmiştir. IDA aminoasidinin potansiyel nöroprotektif etkisi, SH-SY5Y hücre hattıyla, WST-8 testi, LDH testi ve metal şelatlama çalışması yapılmıştır ve AlCl3 maruziyetiyle indüklenen deneysel AH modeli oluşturulan sıçanlarda biyokimyasal, hematolojik, histopatolojik değerlendirmeler ve bununla birlikte moleküler genetik analizler yapılarak belirlenmiştir. Çalışmada 16 adet dişi Sprague-Dawley sıçan kullanılarak 4 grup oluşturulmuştur. Grup 1: kontrol grubu (n=4); Grup 2: AlCl3 maruziyeti ile deneysel AH oluşturulan grup (n=4); Grup 3: tedavi amaçlı IDA uygulanan grup (n=4); Grup 4: IDA grubu (n=4). AlCl3 maruziyeti ile AH oluşturulan sıçanlarda oksidatif stres ve nörodejenerasyon gözlenmiştir. Yapılan moleküler genetik analizler ile alüminyumun β-sekretaz ve γ-sekretaz aktivitelerini artırırken α-sekretaz aktivitesini azalttığı ortaya konmuştur. Bulgularımız IDA aminoasidinin uygulanması ile alüminyum toksisitesinin etkisiyle oluşan nörodejenerasyon ve oksidatif hasar düzeylerinin azaltılabileceğini açıkça ortaya koymuştur. Bu tez çalışması sonucunda elde edilen verilerin AlCl3'e bağlı nörodejenerasyon ve oksidatif strese karşı iyileştirici potansiyele sahip yeni bileşiklerin sentezlenmesine ve yeni tedavi strateji araştırmalarına farklı bir bakış açısı sunacağı kanaatindeyiz.
Yem bezelyesi (Pisum sativum arvense L.) genotiplerinin, prolin içeriğine ve antioksidan enzim aktivitesine bağlı olarak soğuğa karşı direncinin belirlenmesi
Bezelye (Pisum sativum arvense L.), dünya çapında başlıca ticari yem bitkilerinden biridir ancak verimi soğuk stres nedeniyle soğuğa karşı direnci ile sınırlıdır. Bu çalışmada, farklı 31 bezelye genotipinin soğuğa direnç tepkisini, soğuk stres altında test edilmiştir. Bezelye bitkileri, deneylerden 10 gün önce sıcaklık kontrollü bir serada (25/15 °C) tohumlardan yetiştirilmiştir. Soğuğa dirençli ve soğuğa duyarlı hatlar, çeşitler farklı termal analiz değerleri kullanılarak seçilmiştir. Ayrıca antioksidan enzimlerinin (askorbat peroksidaz, katalaz ve süperoksit dismutaz) aktivitesindeki değişimlerin, serbest prolin içeriğindeki değişimlerin ve soğuğa direncin % 50 oranında yapraklarda ölüme neden olan öldürücü sıcaklık (LT50) ile ilişkisi araştırılmıştır. Soğuk aklimasyon ve aklimasyon olmayan koşullarda üç ıslah hattı seçilmiştir. Proline içeriği, aklimasyon olmayan koşullara kıyasla, soğuk aklimasyonda bulunan yapraklarda kademeli olarak artmıştır. Soğuk aklimasyon Askorbat Peroksidaz (APX), Süperoksit Dismutaz (SOD) ve Katalaz (CAT) aktivitelerini geliştirmiştir. Enzim aktiviteleri ile soğuğa karşı direnci arasındaki en yüksek korelasyon 19 ıslah hattının yaprak örneklerinde SOD, APX ve CAT durumunda gözlenmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar, LT50'nin soğuk aklimasyonda prolin içeriği ve antioksidan enzim aktiviteleriyle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir.
Deneysel Parkinson modelinde bor nitrür nanopartiküllerinin nöroprotektif etkilerinin değerlendirilmesi
Parkinson hastalığı (PH) titreme, konuşma bozukluğu, beynin duyarlı bölgelerindeki nöronların kaybı ile karakterize ve dünyada Alzheimer'dan sonra en sık görülen ikinci nörodejeneratif hastalıktır. Son yıllarda yapılan çalışmalar borun insan ve hayvan sağlığı için gerekli bir element olduğunu göster-mektedir. Diğer yandan PH'nn hala kesin olarak tedavisi yapılamamaktadır. Yapılan bu tezde ise anti-oksidan özellikleri, yüksek kararlı kimyasal yapıları ve ilaç taşıyıcı nano boyutlarından dolayı bor nitrür nanopartiküllerinin, MPP+ ile oluşturulan deneysel parkinson modeli üzerindeki nöroprotektif etkileri araştırılmıştır. Tezde, insan embriyonal karsinom Ntera-2 (NT-2) hücre hattı Retinoik Asit (RA) uygula-ması ile nöron benzeri hücrelere dönüştürülmüş ve ardından hücrelere deneysel parkinson modeli oluş-turmak için MPP+ uygulanmıştır. Deneysel parkinson modeline geniş doz aralığında (0,19-100 mg/L) bor nitrür nanopartikülleri uygulanmış ve nanopartiküllerin nöron koruyucu etkinlikleri belirlenmiştir. Hücre-lerdeki canlılık oranlarının belirlenmesi için 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) ve laktat dehidrogenaz (LDH) testleri uygulanmıştır. Ardından toplam antioksidan kapasite (TAK) ve toplam oksidan seviye (TOS) analizleri ile hücrelerdeki antioksidan ve oksidan değerlerin deği-şimleri hesaplanmıştır. Önemli apoptoz belirteçlerinden olan kromozomal integriteleri belirlemek için hücreler, Hoechst 33258 floresan boyama metodu kullanılarak mikroskop altında analiz edilmiştir. Bor nitrür nanopartiküllerin hücrelerdeki asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi üzerine olan etkileri AChE kolo-rimetrik testi ile belirlenmiştir. Son olarak hücrelerin ölüm yolakları akış sitometrisi kullanılarak ortaya konulmuştur. Sonuçlar, bor nitrür nanopartiküllerinin hücreler üzerinde belirli dozlarda herhangi bir toksik etkiye sebep olmadığını göstermiştir. Bor nitrür nanopartikül uygulaması deneysel parkinson modelinde MPP+ toksisitesinin neden olduğu oksidatif stresi azalttığı fakat AChE seviyelerinde herhangi bir etkiye neden olmadığı belirlenmiştir. Akış sitometrisi analizi de bor nitrür nanopartikül uygulamasının deneysel parkinson modelinde canlılığı arttırdığını göstermiştir.
İn vitro şartlarda beş tritikale genotipinin tuz stresine yanıtının bazı biyokimyasal ve fizyolojik parametreler kullanılarak incelenmesi
Tuzluluk, bitki gelişimini kısıtlayan önemli abiyotik streslerden biridir. Tritikale, yüksek kaliteli tohumu, verim potansiyeli ve hastalığa karşı direnci ile bilinen, son derece uygun bir üründür. Bu çalışmada, kallus ve embriyogenik kallus oluşumunda ekili olan beş tritikale genotipinin (Ümran Hanım, Mikham 2002, Melez 2001, Tatlıcak ve Alper Bey) farklı konsantrasyonlardaki tuz stresine verdiği yanıtlar test edilmiştir. Kotiledon eksplantları, kallus indüksiyonu ve embriyogenik kallus oluşumu için eksplantlar olarak seçilmiştir. Test edilen beş tritikale genotipi, kallus büyümelerine ve embriyogenik kallus oluşumlarına göre değişmiştir. Daha iyi kallus indüksiyonu için Ümran Hanım, Tatlıcak ve Alper Bey gözlenirken; benzer şekilde, aynı genotipler, in vitro şartlarda tuzda daha iyi embriyogenik kallus oluşumuyla cevap vermiştir. Tuz stresi altında bu genotiplerin embriyogenik kallus büyümesinde önemli bir azalma gözlenmiştir. Emriyogenik kallusun NaCl' ye verdiği cevaplara göre, beş tritikale genotipi, Tatlıcak> Ümran Hanım> Alper Bey> Mikham 2002> Melez 2001 olacak şekilde sıralanmıştır. Bu beş tritikale genotiplerinin hepsi tuz stresine maruz bırakıldıklarında kontrol bitkilerinden daha fazla prolin ve şeker biriktirmişlerdir. Prolin seviyesi 200 mM' da zirve yapmış, en düşük ve en yüksek içerik 0-200 mM tuz konsantrasyonlarında elde edilmiştir. Çözünebilir şekerlerin birikimi, kontrol gruplarına kıyasla yaklaşık iki kat artmıştır. Tuza duyarlı genotiplerde lipid peroksidasyonu tuza dayanıklı olanlara göre daha fazla olduğu gözlenirken, H2O2 miktarı tuza dayanıklı genotiplerde artarken, tuza duyarlı genotiplerde ise azaldığı gözlenmiştir. Antioksidan enzim aktiviteleri, artan NaCl konsantrasyonuna cevap olarak artan bir eğilim sergilemiştir.
Β-1,3- glukanaz geninin agrobacterium tumefaciens suşlarına transformasyonu
Fungal patojenler tarımsal alanlarda ciddi bir tehlike oluşturmaktadırlar. Hastalıklarla mücadelede fungal hastalıklara karşı direnç oluşturmak için gen izolasyonu ve gen aktarım teknikleri kullanılarak transgenik bitki geliştirilmektedir. Fungal hücre duvarının en bol bileşeni olan β-1,3-glukanın, β-1,3-glukanaz ile yoğun hidrolizi, hücre duvarlarının mekanik kuvvetini zayıflatarak hücre lizizine yol açmaktadır. Bu nedenle bitkilerde β-l,3-glukanaz, patojenik fungus istilasına karşı savunma sisteminde kullanılmaktadır. Bu çalışmada, bitki hastalıklarıyla mücadelede fungal patojenlere karşı direnç oluşturmak için Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile gen aktarım tekniğiyle pKn-glucanase, pKn-sig-glucanase, pSiCiKn plazmitleri içerisindeki Paenibacillus sp'dan klonlanmış 1793 amino asitlik rekombinant DNA fragmanına sahip β-1,3-glukanaz geninin aktarımını içermektedir.
In vıtro şartlarda bazı anesteziklerin prostat kanseri üzerine etkileri
Prostat kanseri, dünya genelinde erkekler arasında akciğer kanserinden sonra en sık görülen kanserdir ve her yıl yüz binlerce ölüme sebep olmaktadır. Prostat kanseri tedavisinde radikal prostektomi, radyoterapi, kemoterapi gibi yöntemler kullanılmakta olup bu süreçler çok sancılı süreçlerdir. Bu ağrılı süreci daha ağrısız bir hale getirmek için yeni çözümler aranırken kanser tedavisine yardımcı olacak maddelerin kullanımı da önemlidir. Bu amaçla anestezik maddelerin kullanımı yeni bir alternatif olarak düşünülmektedir.. Bu nedenle çalışmamızda insan prostat kanseri beyin metastazı DU145 ve kemik metastazı PC3 hücreleri üzerine intravenöz bir anestezik olan propofolün, kemoterapötik bir ajan olan gemsitabin ile ayrı ayrı ve eş zamanlı olarak uygulanması durumunda oluşacak etkiler hem hücresel hem de moleküler düzeyde araştırıldı. Araştırmamızın ilk aşamasında hücre proliferasyon testi CVDK-8 ve laktat dehidrogenaz (LDH) salınım testi yardımıyla söz konusu ajanların toksik olan dozları belirlendi. Devam eden safhalarda ise bu ajanların hücre hatları üzerine olan biyokimyasal etkilerini tespit etmek için Toplam Antioksidan Kapasite (TAK) ve Toplam Oksidan Kapasite (TOD) analizleri ve bu ajanlarla muamele edilen hücrelerde ki onkogenik proteinlerde ifade değişimlerini göstermek amacı ile de western blot analizi gerçekleştirildi. Hem DU145 hem de PC3 hücrelerinde propofolün gemsitabinin etkinliğini arttırdığı tespit edildi. Özellikle propofol ve gemsitabinin eş zamanlı olarak yüksek konsantrasyonlarda uygulandıklarında hücre canlılığını azalttığı ve LDH aktivitesini arttırdığı gözlemlendi. Westen blot analizinden elde edilen sonuçlara göre, bu iki ajanın birlikte kullanımı PI3K/Akt/mTOR yolağının sinerjistik bir şekilde inhibe olmasına yol açtığı görüldü. Söz konusu çalışmadan elde edilen veriler propofol ve benzeri anestezik ajanların kemoterapiye yardımcı olması amacıyla beraber kullanılabileceğinin ön veri potansiyeli taşımaktadır.
Yonca (Medicago sativa L.) genotiplerinde in vitro şartlarda çeşitli nanopartiküllerin tuz stresi üzerine etkilerinin araştırılması
Tuz stresi, bitki gelişimi kısıtlayan faktörlerden birisidir. Medicago sativa L., besin kalitesi en yüksek baklagillerden olup uzun ve köklü bir tarihe sahiptir. Bu çalışmada yonca kallusları (Muş ve Erzurum) ve embriyogenik kallusların oluşumunda kallus oluşum öncesi nanopartikül uygulaması (0,8 ppm CaO, 0,8 ppm ZnO ve 0,8 ppm CuO) kullanarak ve kallus oluşum sonrası nanopartiküller kullanılarak iki hafta boyunca tuz stresi (50 mM) altında etkileri araştırılmıştır. Analiz sonuçlarına bakıldığı zaman tuz stresi altında hücreye en çok hasar tohumdan itibaren gelmeyen nanopartiküller olduğu sonucuna varılmıştır ayrıca alınan Taramalı Elektron Mikroskobu ve Konfokal Lazer Taramalı Mikroskop görüntüleri bu sonucu desteklemektedir. Kallusların Malondialdehit, H2O2 ve Peroksidaz sonuçlarında hücreye en az hasar veren ve en çok hasar veren nanopartiküllerin farklı olduğu görülmüştür. Genotiplerin protein miktarları karşılaştırıldığı zaman sonuçlar da kallus oluşum öncesi nanopartikül uygulaması yapılan 0,8 ppm CuO 50 mM NaCl konsantrasyonu, hücrede en az protein miktarı kallus oluşum sonrası nanopartikül uygulanan 0,8 ppm CuO olduğu görülmüştür. Ayrıca Konfokal Lazer Taramalı Mikroskop görüntülerinde nanopartiküllerin hücrelerde ne kadar biriktiği görülmüştür.
Karboplatin'in baş ve boyun kanseri üzerindeki anti-kanser etkisinin MiR-145 ile ilişkisinin araştırılması
Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC), baş ve boyun bölgesinde sık görülen kanser türlerinden biridir. Karboplatin, HNSCC dahil birçok kanserin tedavisinde kullanılır. Karboplatinin tümör hücrelerinin mikroRNA profilini değiştirdiği gösterilmiştir, ancak, karboplatin sitotoksik etkilerini gösterirken bu süreçte mikroRNA'ların katılımı hakkında sınırlı çalışma vardır. Bu çalışmada, karboplatin uygulaması sonrasında miR-145 ifade seviyeleri ve iyi karakterize edilmiş direkt hedeflerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, karboplatin ve miR-145'in HNSCC hücrelerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisi, Cell Viability Detection Kit-8 kullanılarak değerlendirildi. MiR-145 ve hedeflerinin ifade seviyeleri, karboplatin muamelesi ve p53 inhibisyonu üzerine kantitatif-gerçek zamanlı-PCR kullanılarak değerlendirildi. Western blot, karboplatin ve/veya pifitrin-α ile muamele edilen hücrelerde p53 ve p53'ün asetillenmiş versiyonlarının seviyelerini ölçmek için kullanıldı. Karboplatinin, HNSCC hücrelerinin canlılığını inhibe ettiği ve miR-145 ifade seviyesini doza bağımlı bir şekilde indüklediği gösterildi. MiR-145'in aşırı ifadesine benzer şekilde, karboplatin muamelesi miR-145 doğrudan hedeflerinin ifade seviyesini baskıladı. Ayrıca, miR-145'in transkripsiyonel aktivatörü olan ve karboplatin muamelesi sonucunda aktive olan p53'ün karboplatin ile muamele edilmiş hücrelerde pifitrin-α tarafından inhibisyonunun miR-145 direkt hedeflerin baskılanmasını tersine çevirdiği gösterildi. Sonuçlar, karboplatinin hücreleri öldürme mekanizmalarından birinin DNA hasarı ile aktifleşen p53'ün artan ifadesine paralel olarak miR-145 ve hedeflerinin deregülasyonu olabileceğini göstermektedir. Bildiğimiz kadarıyla bu bulgular, kanser hücrelerinde karboplatin ve miR-145 arasındaki ilişkiyi ortaya koyan ilk bulgulardır.
FGFR inhibitörü AZD4547'nin baş ve boyun kanseri hücrelerinde gelişen taksol direncine karşı potansiyel kullanımının in vitro testlerle araştırılması
Baş ve boyun kanserleri dünya çapında en yaygın görülen kanserler arasındadır. Taksol baş ve boyun dahil birçok kanser türünde tedavide yaygın olarak kullanılır. Ancak taksole karşı gelişen direnç tedavi sürecini olumsuz etkilemektedir. Baş ve boyun kanserinde taksole karşı gelişen direnç mekanizmasının FGFR2'nin aktifleştirdiği PI3K/AKT yolağı aracılığıyla gerçekleştiğine dair bir çalışma bulunmamaktadır. Bu tez çalışması kapsamında AZD4547'in tek başına ve taksol ile birlikte kullanımının kanserle ilişkili hücresel fenotipler üzerindeki etkilerinin araştırılması ve hücrelerde gelişen taksol direncine karşı AZD4547 kullanımının bu direnci aşmakta kullanılma potansiyelinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda öncelikle AZD4547'nin FGFR2'yi inhibe etme potansiyeli ve tümör/normal doku çiftlerinde FGFR2 ve aşağı akış sinyal yolu hedeflerinin ifadeleri western blot ile analiz edildi. AZD4547 ve taksolün baş boyun kanseri hücrelerinde ve AZD4547'nin taksol dirençli Hep-2 hücrelerinde hücre canlılığı, hücre göçü ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerindeki etkileri incelendi. Sonuçlar FGFR2 ve aşağı akış sinyal yolu hedeflerinin tümör dokularında normal dokulara göre daha fazla ifade edildiğini ve AZD4547'in FGFR2 ve hedeflerini etkili bir şekilde inhibe ettiğini gösterdi. Ayrıca AZD4547'nin hücre canlılığı, hücre göçü ve koloni oluşturma potansiyelini azalttığını ve taksol ile birlikte uygulanmasının taksolün etkinliğini artırdığı ortaya konuldu. AZD4547'nin taksole karşı direnç geliştirilen Hep-2 hücrelerinde aşırı ifade olunan FGFR2/AKT/SOX2 aksisini inhibe ettiği ve kanser ile ilişkili hücresel fenotipleri etkili bir şekilde baskıladığı gösterildi. Sonuçlar, AZD4547'in baş boyun kanserinde taksolün tedavi sürecindeki etkilerini artırabileceğine dair ön veriler ortaya koymuş ve taksole karşı gelişen direncin üstesinden gelmek için AZD4547'nin terapötik bir yaklaşım olabileceğine işaret edilmiştir.
Stenotrophomonas maltophilia'dan kitinaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulamaları
Bu tez çalışması kapsamında; kültür koleksiyonumuzda bulunan bakteri izolatlarının kitinaz aktiviteleri araştırıldı ve en iyi kitinaz aktivitesi gösteren izolat belirlenerek klasik (morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal) ve moleküler yöntemlerle (16S rRNA dizi analizi) tanılandı. Stenotrophomanas maltophilia (Gen Bank No: MW600524) olarak tanılanan izolattan kitinaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişim kromatografisi yöntemiyle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin optimum sıcaklık ve pH'sı, Vmax ve Km değerleri ile sıcaklık ve pH stabiliteleri belirlendi. Enzim aktivitesi üzerine çeşitli metal iyonları (Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+), reaktifler (%1-5 EDTA, H2O2, SDS, Tween 20 ve Tween 80) ve çözücülerin (%5-15 DMSO, aseton, gliserol, etanol, izopropanol) etkisi araştırıldı. Saflaştırılan kitinaz enziminin antifungal ve biyoinsektisit olarak kullanılabilirliğinin belirlenmesi amacıyla önemli tarımsal hastalık ve zararlılara karşı etkisi incelendi. Yapılan çalışmalar sonucunda kitinaz enzimi %30 amonyum sülfat konsantrasyonunda %40,7 verimle, 1,4 kat saflaştırıldı. Kısmi saflaştırmanın akabinde iyon değişim kromatografi tekniğiyle HiPrep Q XL 16/10 kolonu ve HiPrep™ 26/10 Desalting kolonu kullanılarak sırasıyla %25,34 ve %18,12 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE yöntemiyle 52 kDa olarak hesaplandı. Enzimin optimum sıcaklığı 50 °C ve optimum pH değeri 7,0 olarak belirlendi. 1 mM konsantrasyondaki Fe2+, Cd2+ve Mn2+ iyonları ile 5 mM konsantrasyondaki Mg2+ ve Fe2+ iyonları enzim aktivesini artırırken, test edilen tüm çözücü ve reaktiflerin enzim aktivitesini düşürdüğü tespit edildi. Kolloidal kitin için enzimin Vmax ve Km değerleri sırasıyla 1,07 µmol.ml-1.dk-1 ve 0,6 mg/ml olarak hesaplandı. Saflaştırılan enzimin Fusarium oxysporium'un çimlenmesi ve hifsel gelişimini olumsuz etkilediği, Leptinotarsa decemlineata böceğinin ise kitin yapısında bozulmalara sebep olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Stenotrophomanas maltophilia, kitinaz, enzim saflaştırma, antifungal aktivite, biyoinsektisit
Melatonin uygulanan fasulye genotiplerinde kuraklık ve tuz stresleri altında sabath gen ailesinin karakterizasyonu ve genom çaplı analizi
Fasulye günümüzde insan beslenmesinde doğrudan kullanılan bir baklagil bitkisidir. Bitkiler sesil organizmalar olmaları dolayısı ile yaşadıkları çevrede birtakım zorluklarla mücadele etmek zorundadır. Bitkilerin karşı kaldığı bu tür durumlara stres denilmektedir. Bitki yaşamında tuz ve kuraklık stresi bu stres koşullarından en önemli iki problemdir. Küresel iklim değişikliği göz önüne alındığında bu iki stres etmenine maruz kalan bitkilerde verimde azalmalar dolayısı ile bitkisel üretimde de azalmalar meydana gelmektedir. Çalışmanın amacı fasulye genotiplerinde kuraklık ve tuz stresi ve bu streslere karşı koruyucu olarak uygulanan melatoninin SABATH gen ailesi üyelerinin genom çaplı analizi ve gen ifade seviyelerinin belirlenmesi ve karakterize edilmesidir. Yapılan bu çalışmada çeşitli in siliko yöntemler kullanılması sonucunda fasulye genomunda 18 SABATH gen ailesi tespit edilmiştir. Bu gen ailesi 30,12 ile 42,73 kDa ağırlığına sahip olup, 268-387 arasında değişen aminoasitten oluşmuştur. Pvul-SABATH genleri arasında belirlenen ekzonların sayısı en düşük 3, en yüksek 4 olarak tespit edilmiştir. Filogenetik analizler sonucunda Pvul-SABATH gen ailesi 3 ana grupta kümelenmiştir. Pvul-SABATH genlerinin ifade seviyeleri farklı dokularda ifade edildiğini ve bitkinin abiyotik streslere karşı tepkide çeşitli fizyolojik roller alabildiklerini göstermiştir. Fasulye bitkisinde SABATH gen ailesi üyelerinin kromozomal lokasyonları, akraba genomlarla olan filogenetik ilişkileri, cis-acting element analizleri in siliko olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları tuz ve kuraklık koşulları altında fasulye bitkisinin ıslahına yardım edebilir.
Magnetron Saçtırma Tekniği kullanılarak yapılan Tungsten-Germanyum kaplamanın tribolojik, biyouyumluluk ve antibiyofilm özelliklerinin belirlenmesi
Germanyum ve Tungsten yaygın olarak endüstride kullanılan elementlerdir. Bu kapsamda 316 L paslanmaz çelik ve borosilikatlı cam numuneler magnetron sputter kullanılarak Germanyum ve Tungsten ile kaplanmıştır. Bu çalışma kapsamında Magnetron sputter ile kaplanan ve kaplanmayan numunelerin tribolojiik özelliklerinin belirlenmesi amacı ile Taramalı Elektron Mikroskobu, X-Işını Difraktometre, Tribometre ve Enerji Dağılımlı Spektroskopi uygulamaları yapılarak belirlendi. Tribolojik özelliklerinin belirlenmesi için yapılan XRD analizlerine göre, WGe2 bileşiğinin (110) yoğun bir yapı gösterdiği ve kristal fazda gözlendiğini göstermiştir. Biyouyumluluk özelliklerinin belirlenmesi amacıyla numunelerde, in vitro olarak Primer Dermal Fibroblast (HDFa) kullanılarak analiz edilmiştir. Germanyum-Tungsten kaplanmış numunelerde ki HDFa hücrelerinde kromozomal anomalilerin belirlenmesi amacıyla genotoksisite testi olan Hoescht 33258 Floresan boyama yapıldı. Hücre canlılıklarının analiz edilebilmesi amacı ile W-Ge kaplanmış, kaplanmamış numune ve plate yüzeyinde ki hücrelere in vitro hücre canlılığı testi olan MTT yapılarak analiz edildi. Magnetron Sputter ile W-Ge kaplanan numuneler de antibiyofilm aktivitesi, kontrol grupları ile kıyaslandığında, doğada yaygın olarak bulunan S. aureus ve P.aeruginosa' da biyofilm oluşturma aktivitesinde önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Yaygın olarak kullanılan Germanyum ve Tungsten'in Tribolojik, biyouyumluluk ve antimikrobiyal aktiviteleri yüzey kaplamalarında araştırılmış ve elde edilen bulgular ışığında biyo-implant malzemesi olarak ilk kez önerilmiştir.
MRSA izolatlarının direnç genleri üzerine sübstitüe fenetilaminlerden sentezlenen yeni β-laktam türevlerinin etkisinin incelenmesi
Modern tıbbın en önemli tedavi araçlarından biri olan antibiyotiklerin tüm dünyada bilinçsizce kullanımı ve bunun sonucunda bakteriyel izolatlarda oluşan direnç ciddi bir sorundur. Bu nedenle uygun ve doğru antibiyotik tedavisi birçok enfeksiyon hastalığında klinik seyir ve prognozu etkilemektedir. Enfeksiyonel hastalıkların tedavisi için seçilecek antibiyotiklerin hedefe uygun ve etkili olması yanında minimum toksisiteye de sahip olması gerekmektedir. Bu bağlamda, β-laktam grubu antibiyotikler de geniş etki spektrumlu ve minimum toksisiteye sahip olmaları nedeniyle en çok reçete edilen ilaçlardır. Tez çalışmasında yeni β-laktam türevleri %41-%91 arasında verimlerle sentezlenmiş ve nozokomiyal enfeksiyonların başlıca sebebi olan MRSA izolatlarına karşı antibakteriyal aktiviteleri araştırılmıştır. Bu hususta ilk olarak izolatlarda mecA ve blaZ direnç genlerinin varlığı tespit edilmiş ve bu izolatlara karşı yeni β-laktam türevlerinin antibakteriyel aktiviteleri tespit edilerek, bileşiklerin MIC değerleri 7,8125-15,625 µg/ml olarak belirlenmiştir. Yapılan antibakteriyel testler sonucunda MSSA ve MRSA izolatlarına karşı en etkili bileşikler olan (25) ve (27) türevleri seçilerek in vitro ortamda direnç oluşturulmuş ve izolatların bu bileşiklere karşı direnç geliştirmediği tespit edilmiştir. Daha sonra MRSA izolatlarına karşı (25) ve (27) bileşiklerinin direnç mekanizmasındaki rolü moleküler (qRT-PCR) ve biyokimyasal (Nitrosefin) analizler ile araştırılmıştır. Çalışma sonucunda bileşiklerin kontrole göre direnç genlerinin ekspresyonunu azalttığı tespit edilmiştir. Nitrosefin analizi ile MRSA izolatlarındaki β-laktamaz enzimi tespit edilerek, (25) ve (27) bileşiklerinin β-laktamaz enzimi üzerindeki etkisi incelenmiş ve bileşiklerin β-laktamaz enzimini inhibe ettiği gözlenmiştir. Ayrıca sağlıklı hücre hattı (HDF) üzerindeki sitotoksik özellikleri araştırılan (25) ve (27) bileşiklerinin doza bağımlı olarak minimum toksisiteye sahip oldukları da belirlenmiştir.
Bazı sucul böcek türlerinin bağırsaklarından bakterilerin izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve antimikrobiyal potansiyellerinin araştırılması
Böceklerin bağırsak florası özellikle çevreye adaptasyonlarında önemli rol oynamaktadır. Son zamanlarda bu flora üyeleri, biyoteknoloji için önemli kaynaklar haline gelmiştir. Hydrophilidae ve Dytiscidae familyalarına ait böcekler, su yaşamına oldukça adapte olmaları nedeniyle mikroorganizmalar açısından zengin bir kaynak olarak görülmektedir. Bu tez çalışmasında yeni antibakteriyel peptit üretici türlerin keşfi için bazı sucul böceklerin bağırsaklarından bakterilerin izolasyonu ve antibakteriyel peptit üretici türlerin taranması hedeflenmiştir. Bu amaçla, Temmuz-Eylül 2020 tarihleri arasında yapılan arazi çalışmalarında Hydrophilidae'ye ait beş, Dytiscidae'ye ait on farklı tür elde edildi. Bağırsak florasını belirlemek için böceklerin aseptik koşullar altında diseksiyonları gerçekleştirildi ve bağırsak örnekleri homojenize edilerek, TSA ortamına yayıldı. Bakterilerin moleküler karakterizasyonları 16S rDNA bölgesine göre gerçekleştirildi. Hydrophilidae üyelerinden Aeromonas veronii, Bacillus pumilus, Carnobacterium divergens, Hafnia paralvei, Kurthia gibsonii, Lactococcus garvieae, Proteus hauseri, Providencia rettgeri, Pseudomonas otitidis, Serratia fonticola ve S. liquefaciens; Dytiscidae üyelerinden ise Acinetobacter radioresistens, Aeromonas sp., A.allosaccharophila, A.veronii, B.pumilus, Carnobacterium divergens, Exiguobacterium mexicanum, Hafnia paralvei, Kurthia gibsonii, Lactococcus garvieae, Paenibacillus amylolyticus, Providencia rettgeri ve P.otitidis türleri elde edildi. Kültür filtratları well difüzyon tekniği ile Staphylococcus aureus ve P.aeruginosa'ya karşı test edildi. Ön seleksiyon sonucunda kültür filtratlarının hiçbiri P.aeruginosa'da zon oluşumuna neden olmazken; 5 adet filtrat S.aureus'a karşı zon verdi. Bakteriler aktivitenin doğrulanması için önce Tripsin/Proteinaz K parçalama yöntemi ile tarandı. Bu deneyde seçilen iki bakteriye ait filtratlar aktiviteden sorumlu proteinin bandının belirlenmesi amacıyla Native-Page jelde yürütüldü ve jel kapatma testine alındı. Sonuçta M29 kodlu P.otitidis'e ait yaklaşık 12 kDa boyutundaki peptidin antibakteriyel aktivite gösterdiği tespit edildi.
Pseudomonas aeruginosa'da biyofilm direnç genleri üzerine bazı antibiyotiklerin etkileri
Pseudomonas aeruginosa Gram-negatif, sporsuz, hareketli, kapsülsüz, çevre koşullarına kolaylıkla uyum sağlayabilen ve aynı zamanda biyofilm oluşturma yeteneğine sahip, fırsatçı bir patojendir. Hastane ve toplum kaynaklı P. aeruginosa izolatları çoklu ilaç direncine ve biyofilm-spesifik antibiyotik dirençliliğine sahiptir. Bu durum tedavilerde büyük problemlere yol açmaktadır. Biyofilm-spesifik antibiyotik dirençliliği veya biyofilm dirençliliği, biyofilm içerisinde büyüyen hücrelerin antibiyotiklere 10-1000 kat daha fazla dirençli olması ile yakın ilişkilidir. Bu tez çalışmasında, P. aeruginosa'da çeşitli genlerin biyofilm yapısındaki hücrelerde daha fazla eksprese edilmesi sonucu oluşan biyofilm dirençliliğinin bazı antibiyotikler varlığındaki durumları incelenmiştir. İlk olarak, P. aeruginosa (PAO1) suşu kullanılarak, siprofloksasin, tobramisin, fosfomisin ve piperasilin/tazobaktam antibiyotiklerinin disk difüzyon testi yapılmış ve mikrodilüsyon testi ile minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri belirlenmiştir. Ayrıca, kristal viole (CV) testi ile minimum biyofilm inhibitör konsantrasyon (MBİK) değerleri ortaya koyulmuştur. Ardından, alt-MİK konsantrasyonlarında antibiyotik uygulaması yapılarak, antibiyotiklerin hareketlilik üzerindeki etkisi incelenmiştir. Son olarak, alt-MİK konsantrasyonda antibiyotik uygulaması ile koloni biyofilm testi yapılmış ve RNA'ları izole edilmiştir. Bu RNA'lar cDNA'ya çevrilerek, RT-PCR ile ndvB, tssC1, PA2070 ve PA5033 genlerinin ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Ek olarak, planktonik kültürlerle karşılaştırması yapılmıştır. Sonuçlarımıza göre, planktonik hücrelere kıyasla, fosfomisin dışındaki antibiyotiklerin biyofilm yapısında biyofilm direnç genlerinin ekspresyon seviyelerini azalttığı görülmüştür. Ayrıca, antibiyotik uygulanmamış biyofilm yapısına kıyasla, antibiyotik uygulama gruplarında biyofilm direnç genlerinin ekspresyon seviyelerinde artış meydana geldiği bulunmuştur.
Belirli kemoterapötikler ve kolesterol ilaçlarının in vitro beyin tümörü modeli üzerine etkilerinin incelenmesi
Beyin tümörleri, diğer tümörlere kıyasla yetişkinlerde daha nadir görülsede, bebeklerde ve çocuklarda kansere bağlı morbidite ve mortalitenin en yaygın nedenlerinden biridir. Beyin tümörleri ile ilgili en büyük sorunlardan biri kemoterapi ilaçlarının kan-beyin bariyeri nedeniyle beyne istenilen dozda ulaşamamasıdır. Kemoterapi ilaçları, tedavi etkinliğini artırmak için diğer ilaçlarla birlikte verilmektedir. Diğer yandan; kolesterol, hayvan hücre zarının önemli bir bileşenini oluşturan steroid maddedir. Kolesterol sentezini düzenleyen kolesterol geri besleme inhibisyon mekanizmalarının kaybı, malign transformasyonun önemli bir özelliğidir. Literatür incelemesinden, tümör büyümesinin inhibisyonunun, kolesterol veya kolesterol sentezinin varlığını kısıtlayarak sağlanabileceği makul bir varsayımdır. Son zamanlarda kolesterol düzenleyici ilaçlar olan simvastatin ve lovastatin ile kemoterapötiklerin (gemsitabin ve karmustin) eş zamanlı uygulanmasının in vitro beyin tümörü modelinde etkilerinin araştırılmadığı bulunmuştur. Mevcut tezde, literatürdeki bu boşluğun doldurulması amaçlanmaktadır. Hücre Canlılığı Tespit Kiti-8, test bileşiklerinin hücre canlılığı üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılmış ve insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde her bileşik için IC20 konsantrasyonları belirlenmiştir. Daha sonra test bileşiklerinin apoptoz üzerindeki etkileri hem kolorimetrik hem de western blot analizi ile ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlara göre, statinler hem tek başına hem de kemoterapötiklerle birlikte uygulandığında doza bağlı bir şekilde proliferasyonu inhibe etmiştir. Özellikle, lovastatinin hem gemsitabin hem de karmustinin etkinliğini artırarak apoptozu indüklediği her iki yöntemde de gösterilmiştir. Yapılan testlerden elde edilen bulguların bir sonucu olarak, statinlerin şu anda kullanılan antikanser ilaçlarının etkinliğini potansiyel olarak artırabilecek yeni bir nöroblastoma tedavi seçeneği olabileceği önerilmektedir.
Sıçanlarda 4NQO ile indüklenen ağız içi kanser modelinde D Vitamini eksik ve/veya kolesterolce zengin diyetlerin neoplastik süreçte hücre içi enerji metabolizması üzerine etkilerinin incelenmesi
Diyet ve beslenme alışkanlıkları karsinogenik süreçler sırasında kritik öneme sahiptir. Hastalarda yüksek kolesterolün kritik nedenleri arasında süt ve süt ürünlerinin tüketiminin olması ve sebze ile meyvelerin vitaminler açısından önemli kaynaklar olması göz önünde bulundurarak, D vitamini eksikliği (VDE) ve yüksek kolesterolün oral skuamöz hücreli karsinomdaki (OSHK) olası rollerini glikolizin modüle edilmesi aracılığıyla araştırılması amaçlanmıştır. Başlangıçta 23 OSHK hastası ile yaş ve cinsiyetçe eşleştirilmiş 30 kontrol bireyin toplam kolesterol, LDL, HDL, trigliserid, LDH ve D vitamini düzeyleri karşılaştırılmıştır ve Pearson Analizini kullanarak bu parametrelerin birbirleri ile korelasyonları incelenmiştir. Gen seti zenginleştirme analizi için GEO veri setleri kullanılmıştır. VDE ve yüksek kolesterolün karsinogenez sırasındaki katkısını glikolizin olası modülasyonu yoluyla araştırmak için 4-nitrokinolin-1-oksit ile indüklenen in vivo oral karsinogenez modelleri kullanılmıştır. Ardından sırasıyla ELISA ve qRT-PCR kullanarak sıçan ağız içi tümör doku örneklerinde kolesterol, laktat ve glikolizle ile ilişkili gen ifade seviyeleri ölçülmüştür. VDE ve yüksek kolesterolün tek başına ve birlikte 4NQO ile indüklenen in vivo kanser modellerinde daha büyük tümörlerin oluşumuna yol açtığını ve bu tümörlerin oluşumunun glikoliz inhibisyonu ile baskılandığı gösterilmiştir. Sonuç olarak, oral karsinogenez sırasında yüksek kolesterol ve VDE'nin ortak katkısını ve bu sürecin temel olarak tümör hücrelerinde enerji metabolizmasının değişimiyle gerçekleştiği bildirilmiştir.
Nöron benzeri hücre kültürüne dönüştürülmüş nöroblastom hücre hattında manyetik alan toksisitesine karşı propolisin nörokoruyucu özelliklerinin belirlenmesi
Sürekli manyetik alan uygulamasının sitotoksik ve nörodejeneratif özelliklerini gösteren kapsamlı çalışma literatürde yoktur. Bu çalışmada, nörodejeneratif özellikleri anlamak için aşırı düşük frekanslı manyetik alanların (ELF-MF'ler) farklılaşmış nöroblastom (SH-SY5Y) hücre hattı üzerindeki sitotoksisite etkileri araştırılmıştır. SH-SY5Y hücre hattını olgun nöron benzeri hücrelere dönüştürmek amacıyla all-trans retinoik asit kullanılmış ve hücre döngüsü analiziyle farklılaşma doğrulanmıştır. ELF-MF'nin dönüştürülmüş hücrelerdeki toksikolojik etkilerini araştırmak için hücre kültürüne çeşitli aralıklarda ELF-MF'ler uygulanmıştır. Ayrıca, geniş doz aralığında propolis uygulanarak manyetik alanın olumsuz etkileri nöron hücreleri üzerinde azaltılmaya çalışılmıştır. Hoechst 33258 boyama, maruziyetten sonra kromozomal aberasyonların oluşumlarını araştırmak için kullanılmıştır. ELF-MF'ye maruz bırakıldıktan sonra, hücre ölüm mekanizmasını belirlemek amacıyla nekroz ve apoptoz için akış sitometrisi analizi yapılmıştır. ELF-MF'lerin nöronal hücreler üzerindeki mutasyon oluşturma potansiyelini araştırmak için apurinik/apirimidinik siteler değerlendirme testi kullanılarak DNA hasarı oluşumları gözlemlenmiştir. Toplam Antioksidan Durum (TAS) ve Toplam Oksidan Durum (TOS) parametreleri, oksidatif stresle sonuçlanan DNA hasarını ilişkilendirmek için araştırılmıştır. Hücre kültürlerine çeşitli aralıklardaki manyetik alan uygulamaları %37,6, %44,2 ve %48,2 nekrotik hücre ölümü ile sonuçlanmıştır. Ayrıca, ELF-MF maruziyetinden sonra DNA hasarı birikimi artmıştır. ELF-MF uygulaması, olgun nöron benzeri hücrelerde nekrotik etki göstermiştir. Propolis uygulamasıyla ELF-MF'lere maruz kalan hücre kültürlerinde sitotoksisitenin düştüğü ve oksidatif stres parametrelerinin neredeyse normal seviyelere geldiği belirlenmiştir. Bu sonuçlar, sürekli ELF-MF maruziyetinin, artan oksidatif stres, nükleer mutasyonlar ve nöronal hücrelerde nekrotik hücre ölümü yoluyla nörodejeneratif hastalığa neden olabileceğini ortaya koymaktadır. Propolis gibi bir antioksidan uygulamasının manyetik alan toksisitesinin önüne geçebileceği belirlenmiştir.
İnsan β-defensin-2 proteininin Pichia pastoris'te rekombinant üretimi
Antimikrobiyal peptitler (AMP) 6-100 aminoasit içeren ve canlılar tarafından üretilebilen genelde katyonik, hidrofobik, lizin ve arjinin aminoasitleri açısından zengin olan kısa peptidlerdir. İnsan beta defensin-2 (hBD-2), düşük molekül ağırlıklı, sistein açısından zengin katyonik özellik içeren, epitel hücrelerinde enfeksiyon durumunda üretimi artan antimikrobiyal bir peptidtir. Pichia pastoris ökaryotik protein üretimi için kullanılabilen yüksek ifade, indüklenebilirlik, ökaryotlara yakın glikolizasyon mekanizması gibi avantajlara sahip ekspresyon sistemidir. Bu tez çalışmasında, FaDu (ATCC® HTB-43™) hücre hattı Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) bakterileri ile indüklenmiş ve RNA izolasyonu yapılmıştır. Bu RNA'lardan cDNA sentezi yapılmış ve özgün primerler kullanılarak hBD-2 polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmıştır. Elde edilen hBD-2'nin önce pGEM-T easy vektörüne alt klonlaması yapılmıştır. Ardından pPICZαA vektörüne klonlaması yapılarak elektroporasyon yöntemi ile P. pastoris X-33 hücrelerine transforme edilmiştir. hBD-2 peptidinin, elde edilen rekombinant P. pastoris'te AOX promotörü kontrolünde 30 ℃'de 96 saat boyunca üretimi agar difüzyon testi, qRT-PCR, SDS-PAGE ve western blotlama yöntemleri kullanılarak izlenmiştir. Sonuçta, hBD-2 peptidinin 30 ℃, 150 rpm'de ve %2 metanol indüklemesi ile 96 saatte üretiminin gerçekleştiği tespit edilmiştir. Elde edilen fonksiyonel özelliklerini koruyan hBD-2 peptidi terapötik amaçlar için kullanılabilir.
Leishmania major ile enfekte edilen gerbillerde bazı inflamatuar ve kompleman yolak genlerin ifadelerinin mRNA ve protein düzeyinde araştırılması
Hücre içi protozoonlardan biri olan Leishmania türlerinin neden olduğu leishmaniasis, deri ve iç organ enfeksiyonlarına neden olan ve son yıllarda prevalansı artan sistemik, kronik bir hastalıktır. Toplum sağlığı açısından önemli görülen ve immün sistem hücrelerini de enfekte edebilen Leishmania türlerine karşı immün sistemin oluşturduğu bağışıklık mekanizmaları tam olarak ortaya konulamamıştır. Bu amaçla yola çıkılan çalışmada, gerbillerde (Meriones unguiculatus), L. major enfeksiyon modelinin oluşturulması, Leishmania enfeksiyonlarına karşı immün sistem hücrelerinin cevabının belirlenebilmesi için IL-1β, IL-2, IL-6, IFN-ɣ, TNF-α genlerinin ekspresyon seviyeleri ile inflamatuar yanıttaki rollerinin araştırılması, kompleman sistemde lektin yolağının rolünü incelemek için MBL-1, MBL-2, C2, C3 genlerinin ekspresyon seviyeleri ile bu genlerden MBL-1, C2, C3 proteinlerinin seviyelerinin belirlenmesi, gerbillerde enfeksiyona karşı oluşabilecek oksidatif stresin tespiti için biyokimyasal testler (GSH ve MDA)'in yapılması ve son olarak kandaki lökosit sayılarının değerlendirilmesi için de hematolojik analizlerin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda ilk olarak gerbillerde kutanöz leishmaniasis hayvan modeli oluşturulmuş ve lezyon bölgelerinden alınan örneklerde mikroskobik incelemeler ve kültür çalışmaları ile parazitlerin varlığı tespit edilmiştir. Enfekte edilen gerbillerde inflamatuar sitokin ve kompleman sistem genlerinin ekspresyon seviyelerinin ve bazı kompleman sistem proteinlerinin önemli ölçüde arttığı, azalan GSH ve artan MDA düzeylerine bağlı olarak oksidatif stresin oluştuğu ve enfeksiyona bağlı olarak lökositlerin miktarında da önemli düzeyde artış olduğu tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda, kutanoz leishmanisis enfeksiyonlarında Th1, Th2 ve kompleman sistem yolaklarının aktive olduğu belirlenmiş olup, hastalığın patogenezinde farklı immunpatolojik mekanizmaların da değerlendirilmesi gerektiği kanaatine varılmıştır.
SSR markörleri kullanarak Türkiye'nin farklı yerlerinden toplanan yonca (Medicago sativa L) popülasyonları arasındaki genetik çeşitliliğinin belirlenmesi
Medicago sativa, Baklagiller (Fabaceae) ailesine mensup çok yıllık, besin değeri yüksek yem bitkisidir. Yonca baklagil bitkileri içerisinde uzun ömürlü olması ve farklı çevresel koşullara karşı dayanıklı olması nedeniyle en çok tercih edilen türlerden biridir. Bu çalışmada yonca yetiştiriciliğinde büyük paya sahip olan Türkiye'nin farklı bölgelerinden toplanan yonca populasyonlarının genetik çeşitliliğin SSR markörları kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Böylece ülkemiz açısından ekonomik önemi olan, bölgeye uygun yonca çeşitleri geliştirmeye yönelik ıslah programlarına katkıda bulunmak hedeflenmiştir. Tez çalışmamızda, Türkiye'nin farklı bölgelerinden toplanmış olan 72 yonca populasyonu kullanılmış ve basit dizi tekrarları (SSR) kullanılarak populasyonlar arasındaki genetik uzaklık belirlenmiştir. Farklı bölgelerden alınan tohumlar MS ortamına ekimi yapılıp, fidelerden alınan genç yaprak örneklerinden CTAB metoduna göre DNA izolasyonu yapılmış ve seçilmiş SSR primerleri ile yapılmış PCR işlemleri sonucunda oluşan bantlarda populasyonların genetik çeşitlilik analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizlerden elde edilen sonuçlar Türkiye'de yetiştirilen yerel yonca popülâsyonlarının yerel kültüvarlar ve ticariler şeklinde 2 ana gruba ayrıldığını göstermiştir. Elde edilen sonuçlar STRUCTURE, PCA ve filogenetik analizlerle doğrulanmıştır. Çeşitlilik analizleri neticesinde bu popülâsyonlarda 0.28'lik heterozigotluk oranı elde edilmiştir. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan SSR markörlerinin ilgili genotipler için bilgi verici olduğu sonucuna da varılmıştır. Çalışma sonucunda Türkiye'nin farklı yerlerine ait yonca populasyonlarının sahip olduğu genetik çeşitlilik SSR markörleri ile ortaya konulmuştur.
Bazı antibiyotik ve antibiyofilm peptid kombinasyonlarının Staphylococcus aureus biyofilm yapısı üzerine etkisi
Antibiyotik direncinin hızla yayılması ve yeni antimikrobiyallerin keşfedilmesinin zorluğu nedeniyle daha önceden keşfedilen antibiyotiklerin yeniden kullanım ve kombinasyon stratejileri ön plana çıkmıştır. Bu çalışmada, kloramfenikol ile siprofloksasinin ve nisin antibiyofilm peptidi ile Staphylococcus aureus ATCC 6538 suşuna karşı kombinasyonel etkinliğini araştırıldı. Siprofloksasin, nisin ve kloramfenikolün MIC değeri sırasıyla 0,25, >64 ve 32 μg/mL idi. Kloramfenikol ile siprofloksasinin ve nisin molekülü arasındaki sinerjizmin incelenmesi için checkerboard (dama tahtası) testi yapıldı. Kristal viyole testi ile antibiyofilm etkilerinin değerlendirilmesi gerçekleştirildi. Ayrıca, koloni biyofilm testi ve qRT-PCR kullanılarak çeşitli virülans genlerinin (agrA, spa, icaA ve saeR) ifadeleri araştırıldı. Nisin, kloramfenikol ve kombinasyon uygulamalarında agrA geninin ekspresyon seviyesinin kontrole göre azaldığı gösterildi. Diğer genlerin ekspresyon seviyelerinin ise kontrol grubuna göre artış gösterdiği belirlendi. Sonuçlar, nisin ve kloramfenikol kombinasyonunun aktivitesinin sinerjistik ve antibiyofilm aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Ancak nisin ile siprofloksasin arasında bir etkinlik belirlenmedi.
ING-3 geninin baş boyun kanserlerinde fonksiyonunun araştırılması
Agresif bir kanser türü olan baş ve boyun kanserleri dünya genelinde en sık tanısı konan kanserler arasındadır. Dünya genelinde baş ve boyun kanserleri 5 yıllık sağkalım oranları %60'lar civarında olmasına rağmen, ülkemizde bu oran dünya ortalamasının oldukça altındadır. Inhibitor of growth protein (ING) ailesi 5 üyeden oluşmaktadır (ING1-5). ING proteinleri çok sayıda hücresel süreçte önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle ING genlerinin ifade değişiklikleri tümör oluşumu ile ilişkilendirilebilir. Bu tezde, ING ailesi üyelerinin ifadelerinin analizi ve baş ve boyun kanserlerinden olan larenks kanserinde ING genlerinin prognostik öneminin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, larenks tümör ve normal doku çiftlerinde rölatif ING gen ailesi ifadesi mRNA seviyesinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak, rölatif ING3 ifadesi protein seviyesinde Western blot analizi kullanılarak değerlendirildi. ING genlerinin ifade seviyeleri, genetik değişiklikleri ve sağkalım verileri online veritabanları kullanılarak araştırıldı ve ING3'ün protein etkileşim ağı STRING web portalı kullanılarak ortaya koyuldu. Baş ve boyun kanserlerinde ING3'ün genetik değişiklik oranının oldukça yüksek olduğu gösterildi. ING3'ün hem mRNA hem de protein seviyesinde larenks kanseri doku örneklerinde normal doku örneklerine kıyasla artan ifadeye sahip olduğu doğrulandı. Yüksek ING3 ifadesinin, baş ve boyun kanseri hastalarının hastalıksız sağ kalımı ile ilişkili olduğu gösterildi. Ayrıca, birlikte ifade analizi, EPC1'in önemli ölçüde ING3 ile ilişkili kritik bir gen olduğunu ortaya koydu. Tez kapsamında elde edilen bulgular, ileri evre larenks kanseri vakalarında ING3'ün yüksek düzeyde ifade edildiği ve onkogenik potansiyel sergileyerek larenks kanser gelişim sürecine önemli derecede katkıda bulunduğunu gösterdi. ING3'ün ileri evre larenks kanser hastaları için hayati prognostik önemi, biyobelirteç olarak kullanılabilme potansiyelini ortaya koymaktadır.
Erzincan cimin üzümü çekirdek ekstraktının anti-alzheimer potansiyelinin değerlendirilmesi
İnsanlarda ortalama yaşam süresinin artması güzel bir gelişme olmakla birlikte beraberinde yaşlanmaya bağlı hastalıkların artmasına yol açmıştır. İleri yaşta görülen demansın 2/3'ünden sorumlu olan Alzheimer'ın sebebi bilinmemekle beraber hastalığın tedavisi de yoktur. Bu yüzden bilim insanları AH'yi engelleyecek alternatif yollara yönelmiştir. Bu çalışmamızda Vitis vinifera'nın bir alt türü olan ve Erzincan'da endemik yetişen Cimin Üzümü çekirdek ekstraktının anti Alzheimer potansiyelinin değerlendirilmesi yapılmıştır. Erzincan Cimin Üzümü Çekirdeğinin sulu ekstresi in vitro Alzheimer modeli olan SH-SY5Y hücre kültürüne uygulanmıştır ve toksisitesine karşı nörokoruyucu etkisi araştırılmıştır. Hücre canlılığı testi için MTT ve LDH testi yapılmıştır. Apoptotik çekirdeklerin saptanması için Hoechts 33258 ile boyanıp incelenip floresan mikroskobu altında fotoğraflanmıştır. Ayrıca Asetilkolinesteraz aktivitesi ölçülmüştür. Elde edilen bulgular Cimin üzümü çekirdeğinin sulu ekstresinin toksisitesine karşı hücre canlılığını artırıp antioksidan kapasiteyi destekleyerek nörokoruyucu olduğunu göstermiştir.
Alzheimer hastalığının tedavisine yönelik bor nanoteknolojisi temelli ilaç taşıma sisteminin geliştirilmesi
Son yıllarda Alzheimer gibi yıkıcı nörodejeneratif hastalıkların daha etkin ve yenilikçi tedavisini amaçlayan çalışmaların sayısı hızla artmaktadır. Bu tez çalışmasında esterifikasyon reaksiyonu ile yüzeyine folik asit (FA) tutturulmuş hekzagonal bor nitrür (hBN) temelli taşıyıcı sistem tasarımı gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan hBN-FA taşıma sisteminin SEM-EDX, UV-vis spektrumu, FTIR ve Zetasiezer analizleri ile detaylı karakterizasyon çalışmaları tamamlanmıştır. Taşıma sisteminin toksikolojik değerlendirilmesi insan dermal fibroblast hücre kültürlerinde gerçekleştirilmiştir. hBN-FA taşıma sisteminin Memantin(MEM) ve bor lipoik asit (BLA) yükleme ve salınım profili değerlendirilmiş ve ardından retinoik asit ile olgun nöron benzeri hücre dönüşümü sağlanan SHSY-5Y hücrelerinde MTT analizi ile sitotoksisite çalışması yapılmıştır. İlaç yükleme sonuçları FA ile kaplanmayan hBN'nin BLA'yı yükleme yeteneğine sahip olmadığını ancak MEM için %84,3 ilaç yükleme etkinliğine sahip olduğunu göstermiştir. Öte yandan hBN-FA taşıma sisteminin BLA ve MEM için ilaç yükleme etkinliği sırasıyla %97,5 ve %95'tir. Dönüştürülmüş SHSY-5Y hücre kültüründe 20µM Aβ(1-42) peptidi ile in vitro Alzheimer hastalık modeli oluşturularak ilaç yüklü taşıma sisteminin Aβ(1-42) toksisitesine karşı nöron koyucu potansiyeli değerlendirilmiştir. hBN-FA+BLA in vitro AH modelinde %99 oranında hücre canlılığı gösterirken; hBN-FA+MEM'in aynı konsantrasyonu ile tedavi edilen hücre grubunda canlılık %94 olarak hesaplanmıştır. Dahası AChE aktivitesi tayini, TAK ve TOS analizi, Akış sitometrisi ve genotoksisite çalışmaları sitotoksisite verileriyle köreleydi. Tüm bulgular hazırlanan taşıyıcı sistemin in vitro deneysel AH modelindeki ilk kez aydınlatılmış nöroprotektif etkisinin umut verici olduğunu ve daha detaylı araştırmalar için önemli veriler sunduğunu göstermektedir.
İn vitro Alzheimer hastalık modelinde sodyum ve potasyum'lu bileşiklerin nöron koruyucu etkilerinin değerlendirilmesi
Alzheimer hastalığı, hafızayı ve düşünme becerilerini ve nihayetinde en basit görevleri yerine getirme yeteneğini yavaş yavaş yok eden nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu çalışmamızda, İnsan nöroblastoma hücre hattı (SH-SY5Y) retinoik asit uygulanmasıyla nöron benzeri hücrelere dönüştürülmüştür. Dönüşen hücreler Alzheimer benzeri ortam oluşturmak amacı ile H2O2 geniş doz aralıklarıyla uygulandı (0-200 μM) ve H2O2'nin IC50 değeri MTT canlılık testiyle analiz edilmiştir. Sonuç olarak elde edilen IC50 değeri kültürlere uygulanarak aday moleküllerin koruyucu etkileri incelendi. Sitotoksik çalışmaları gerçekleştirilmiş olan 9 adet sodyum/potasyum bazlı bileşiklerden Sodyum Hidrojen Fosfat, Sodyum Sitrat Tirbazik Dihidrat, Sodyum Hidrojen Karbonat, Sodyum Fosfat Dibazik ve Potasyum Tartarat moleküllerinin belirli dozlarda toksisiteye neden olmadığı bu yüzden nöron koruyucu özellikleri Alzheimer hastalığı modellinde denenebileceği belirlendi. Yapılan çalışma sonucunda. Bu moleküller arasında sodyum hidrojen fosfat, sodyum hidrojen karbonat, sodyum sitrat tribazik dihidrat ve potasyum tartarat moleküllerinin μg/ml konsantrasyon seviyesinde de hücre canlılığını H2O2 uygulanmasına kıyasla önemli seviyelerde arttırdığı tespit edilmiştir. Ardında hücre hattındaki toksisitenin yol açtığı apoptoz /nekrozları belirlemek amacıyla Annexin-V/PI incelemesi flov sitometri yöntemi kullanılmıştır. Hücre hattında ki apoptoz ve çekirdek integritisi, Hoechst 33258 floresan boyama metodu kullanılarak mikroskop altında incelenmiştir. Son olarak, seçilen sodyum ve potasyumlu bileşiklerin asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi, toplam antioksidan kapasite (TAK) ve toplam oksidatif durum (TOD) seviyeleri üzerine olan etkileri belirlenmiştir. Sonuçlara göre, seçilen bileşiklerin kastrasyonlarının H2O2 karışı koruyucu etkileri hücre canlılık testleriyle gösterilmişidir. Seçilen bileşiklerin hücrelerde gerçekleşen nekroz ölümlerinde önemli ölçüde düşüşe neden olduğu flov sitometri sonuçlarıyla gösterilmiştir. Yapılan çalışmalar ışığında seçilen bileşiklerin uygulamalarının AchE aktivitesinde ve TOD seviyesinde azalmaya ve TAK seviyesinde atışa neden olduğu gözlenmiştir. Bulgularımız, seçilen bileşiklerin anti-Alzheimer aktivitesini ortaya koymuştur.
İn vitro şartlarda azasitidin uygulamasının yonca kalluslarında antioksidan sistem ile SERK1 ve WEE1 gen ifadesi üzerine etkisinin incelenmesi
Yonca yüksek besin değeri, verim potansiyeli biyotik ve abiyotik stress faktörlerine dayanıklı olmasından dolayı dünyadaki en önemli yem bitkisidir. Bu çalışmada, Yonca bitkisinin yaprak eksplantlarından alınan kalluslar 0.0125mg\mL kinetin+1mg\mL 2.4-D, 0.0125mg\mL kinetin+1mg\mL 2.4D+2,5μM 3µL 5-azaC, 0.0125mg\mL kinetin+1mg\mL 2.4D+2,5μM 6µL azasitidin (5-azaC) içeren ortamlarda 7, 14 ve 21 gün yetiştirilmiş ve yonca kalluslarında malondialdehit (MDA) miktarı, hidrojen peroksit (H2O2) seviyesi, süperoksit dismutaz (SOD) ve peroksidaz (POD) enzim aktivitelerinde meydana gelen değişimler, prolin, toplam protein, dinitrosalisilik asit (DNSA) ve toplam fenolik madde miktarları belirlenmiştir. Buna ilaveten, azasitidin uygulamasına bağlı olarak Somatik Embriyogenez Reseptör Kinaz 1 (SERK1) ve G2 Kontrol Noktası Kinaz (WEE1) genlerinin ifadelerinde meydana gelen değişimler ölçülmüştür. Azasitidin uygulamasına bağlı olarak MDA ve H2O2 miktarlarının azaldığı, SOD aktivitesi ve protein miktarının düştüğü, POD aktivitesi ve prolin miktarının arttığı belirlenmiştir. SERK1 ve WEE1 genlerinin ifadelerinin uygulanan azasitidin konsantrasyonuna ve zamana bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir.
İnsan baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomunda POFUT1 geninin malign fenotipler ve perinöral invazyon ile ilişkisinin araştırılması
Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (BBSHK) dünya genelinde en sık görülen agresif malign hastalıklardan biridir. POFUT1 geninin yüksek düzeyde ifadesinin karsinogenez sürecinde önemli rol oynadığı gösterilmesine rağmen, BBSHK'de POFUT1'in rolü ve moleküler mekanizmaları şimdiye kadar araştırılmamıştır. Bu tez çalışması kapsamında yapılan in siliko analizler POFUT1'in BBSHK'de onkogenik role sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tümör ve normal doku örneklerinin, BBSHK hücrelerinin daha ileri analizi kontrollere kıyasla BBSHK klinik tümör doku örneklerinde ve hücre hatlarında POFUT1'in yüksek düzeyde ifade edildiğini ortaya koymaktadır. In vitro araştırmalar, POFUT1'in yüksek düzeyde ifadesinin kanser agresifliği ile ilişkili fenotipleri uyardığını ve POFUT1'in BBSHK hücrelerinde susturulmasının bu fenotipleri baskıladığını göstermiştir. Yapılan ksenograft deneylerle, POFUT1'in BBSHK için aynı zamanda in vivo potansiyel bir onkogen adayı olduğu belirlenmiştir. Doku örneklerinin immünohistokimyasal analizi ve kanser hücresi-DRG ex-vivo ko-kültür modeli, POFUT1 ifadesinin deregülasyonunun BBSHK hücrelerinin perinöral invazyonunda önemli rol oynadığını ortaya koymuştur. Tez kapsamında elde ettiğimiz bulgular, POFUT1'in baş ve boyun kanserli hastalar için potansiyel bir prognostik belirteç olduğunu ve BBSHK karsinogenezi ile ilgili işlevlerini daha iyi tanımlamak için daha fazla moleküler araştırmaya ihtiyaç duyulmasına rağmen, BBSHK tedavisi için bir hedef olarak potansiyelini vurgulamaktadır.
İnsan baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomlarında miR-1825'in rollerinin belirlenmesi
Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinoma (BBSHK), yılda yaklaşık 600.000 yeni vaka ile dünya çapında görülen en yaygın altıncı kanserdir. Son yıllarda BBSHK'nin tanı ve tedavisinde önemli gelişmeler olmasına rağmen hala kanser nedenli ölümlerin dikkate değer sebeplerinden biridir ve ileri BBSHK vakalarına karşı yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi ve onkogenlerin karakterize edilmesi acil bir gerekliliktir. Bu tez çalışmasında, miR-1825'in BBSHK patogenezindeki in vitro ve in vivo rollerinin anlaşılması, olası yeni hedef genlerinin belirlenmesi ve BBSHK hücrelerinden türetilen eksozomların hipoksik koşullar altında anjiyojenez oluşumu üzerine etkilerinin in vitro testlerle araştırılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda BBSHK hücrelerinde miR-1825 deregülasyonunun hücre canlılığı, göçü, invazyonu, apapotozu gibi kanser ilişkili fenotipler ile hücrelerin kök hücre potansiyelleri üzerine etkileri bir kısım in vitro testlerle incelenerek ortaya çıkarıldı. MiR-1825'in ifadesinin ektopik olarak arttırıldığı veya azaltıldığı BBSHK hücrelerinde miR-1825'in potansiyel hedeflerini belirlemek için gen mikrodizin analizi yapıldı ve ifadesi anlamlı olarak değişen olası aday hedef genler tespit edildi. Ayrıca ektopik miR-1825 aşırı ifadesinin BBSHK hücrelerinin tümör oluşturma kapasitesini artırıcı yönde etki ettiği in vivo NUDE fare modelinde gösterildi. Ek olarak, miR-1825'in BBSHK oluşumunda mikroçevre üzerindeki etkilerini ortaya koymak amacıyla hipoksik koşullara maruz kalan BBSHK'li hücrelerde ve bu koşullarda hücrelerden salınan eksozomlarda miR-1825 seviyesinin arttığı gösterildi. Hipoksik koşularda salınımı artan eksozomların ve eksozomlarca taşınan miR-1825'in damar endotel hücrelerinin (HUVEC) anjiyojenik potansiyelini artırdığı bir kısım in silico analizlerle ve in vitro çalışmalarla ortaya çıkarıldı. Elde ettiğimiz bulgularla BBSHK gelişiminde miR-1825/FREM1 aksisinin rol aldığı ve BBSHK oluşumuna bağlı olarak oluşabilecek hipoksik koşullarda eksozomal miR-1825'in TSC2/mTOR aksisini hedefleyerek anjiyojenez oluşumunu uyardığı ortaya konuldu.
In vitro şartlarda kuraklık stresine maruz bırakılan bazı yerel yonca (Medicago sativa L.) ekotiplerinin kalluslarına uygulanan CaO NPs'nin ve grafen oksitin (GO) mtr-miR159 ve mtr-miR393 gen seviyelerindeki değişikliğin tespit edilmesi
Yeryüzünde verimli toprakları etkisi altına alan kuraklık stresi, bitkilerin fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler mekanizmalarında önemli değişikliklere neden olup tarımsal alanları olumsuz şekilde etkilemiştir. Nanoteknoloji çevresel faktörlerden kaynaklanan olumsuz etkileri çözmek için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu çalışmada, kuraklık stresine maruz bırakılan iki farklı yonca ekotipi doku kültürü şartlarında CaO NPs ve GO uygulaması yapılarak fizyolojik, biyokimyasal ve gen seviyesindeki değişikliklere karşı test edilmiştir. Öncelikle Erzurum ve Konya yöresinden toplanmış olan farklı yerel ekotiplerinin tohumları MS ortamında rejenerasyonu sağlanmış, rejenerasyon sonucu oluşan yonca yaprakları 2,4-D ve Kinetin ortamına alınarak kallus oluşumu sağlanmıştır. Oluşan bu kallus örneklerine farklı konsantrasyonlarda mannitol (50 ve 100 mM), CaO NPs ve GO (0,5 ve 1,5 ppm) içeren ortamlarda 1 ay süre ile bekletilmiştir. Kallus dokularında mannitol konsantrasyonu artıkça kuru/yaş ağırlığının azaldığı CaO NPs ve GO uygulamasında ise arttığı gözlemlenmiştir. Prolin, DNSA, MDA ve H2O2 kuraklık stresiyle doğru orantılı bir şekilde artış olurken, CaO NPs ve GO ise azalış göstermiştir. Fizyolojik ve biyokimyasal analizlerin sonucuna göre Erzurum için en ideal ortam 50 mM mannitol/ 2 CaO NPs/0,5 ppm GO iken Konya için ise 50 mM mannitol/ 0,5 ppm GO'dır. mtr-miR159 ve mtr-miR393 gen seviyesinde meydana gelen değişiklikte kuraklık stresi artıkça yukarı regülasyon CaO NPs ve GO uygulamasında ise aşağı regülasyon olmuştur. Yonca dokusundaki Ca2+ birikimi ise SEM ve CLSM kullanılarak doğrulanmıştır. Sonuç olarak, doku kültürü koşullarında CaO NPs ve GO uygulanmasının kuraklık stresine karşı yonca kallusları üzerindeki olumsuz etkileri önemli ölçüde azalttığını göstermiştir.
Enginar yaprağının sulu ekstraktının alkole bağlı olmayan yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) üzerine in vivo ve in vitro etkinliğinin değerlendirilmesi
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) karaciğerin kütlesinin %5'inin üzerinde yağ oranına sahip olduğu, dünyadaki en yaygın kronik karaciğer hastalığı olup yetişkin popülasyonun %30'unda görülmektedir. NAFLD geniş bir hepatik fenotip yelpazesini kapsayan karmaşık bir hastalıktır. Bu sebepten etkili tedavi stratejileri, bitkisel ve kimyasal çeşitli ilaç destekleri bulunmamakta, geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Buna karşın bu çalışma ile terapötik ajan olarak geleneksel tıpta yaygın olarak kullanılan enginar yaprağının sulu ekstresinin hedef hastalığımız olan NAFLD üzerindeki potansiyel etkisi in vitro koşullarda HepG2 hücrelerinde oleik asitle oluşturulan NAFLD modeli üzerinde hücre canlılığı, TAS-TOS, moleküler genetik teknikler kullanılarak belirlenmiş olup ardından etkinliği belirlenen güvenli doz Sprague-Dawley ırkı ratların üzerinde yüksek yağlı diyetle beslenerek oluşturulan NAFLD modelinde biyokimyasal, hematolojik ve histopatolojik değerlendirmeler yapılarak belirlenmiştir. Çalışmada 15 adet sıçan kullanılmıştır. Grup 1(sağlıklı kontrol n=5), Grup 2(model kontrol n=5), Grup 3(tedavi grubu n=5) olmak üzere 3 grup oluşturulmuştur. HepG2 hücrelerinde oleik asit maruziyetiyle oluşturulan NAFLD modelinde lipit birikimi görülmüş model ORO boyama ile doğrulanmıştır. Ayrıca tedavi uygulanan gruplarda enginar yaprağının sulu ekstresinin hücre canlılığını arttırdığı, oksidatif stresi iyileştirdiği antioksidan kapasiteyi arttırdığı belirlenmiştir. Yüksek yağlı yemle beslenen ratlarda oluşturulan NAFLD modelinde ise model kontrol gruplarında karaciğer parametreleri artmış olup tedavi sonrasında iyileşme görülmüştür. Bu çalışma sonucunda elde edilen bulgular neticesinde enginar yaprağının sulu ekstresinin NAFLD'nin oluşturduğu metabolik bozukluklara karşı iyileştirici potansiyele sahip olduğu belirlenmiş ve bu hastalığa karşı yeni tedavi stratejileri geliştirilmesine ve çeşitli farmakolojik araştırmalara katkı sağlayacağına inanılmaktadır.
Klorheksidin glukonat ve lavanta esansiyel yağkombinasyonlarının metisilin dirençli Staphylococus aureus(MRSA) izolatları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) izolatlarında antimikrobiyal ilaçların yanında antiseptik maddelere karşı da artan dirençliliğin olduğu bilinmektedir. Bu nedenle yeni ve etkili antimikrobiyal ajanların belirlenmesi veya etkili olduğu tespit edilen bu maddelerin tedavilerde kullanıma hazır hale getirilmesi son derece önemlidir. Literatürde kombinasyonel tedavilerin öneminin arttığı bilindiğinden bu çalışmada MRSA izolatlarına karşı antibakteriyel etkinlik gösteren lavanta esansiyel yağı (LEO) ile klorheksidin (CHG) bileşiklerinin kombinasyonel etkileri araştırıldı. Bu bağlamda hastaneden temin edilen klinik izolatlar ile kültür koleksiyonundan alınan MRSA ve MSSA izolatlarına karşı antimikrobiyal ajanların hem tek başına hem de birlikte kullanımının in vitro koşullardaki etkisi disk difüzyon ve mikrodilüsyon testleri yapılarak değerlendirildi. Tüm izolatlar için direnç genlerinin (mecA, qac A/B ve qacC) varlığı araştırıldı ve kombine edilen bileşiklerin checkboard testi ile sinerjistik etkileri, time kill testi ile de farmakodinamik özellikleri belirlendi. Disk difüzyon testi sonuçlarına göre test edilen ajanların tamamının izolatlar üzerinde etkili olduğu tespit edildi ve MIC değerleri belirlendi. Direnç genlerinin varlığına yönelik yapılan çalışmalarda MSSA izolatı hariç tüm izolatlarda direnç genlerinin var olduğu, checkboard testi sonucuna göre kombinasyonun test edilen tüm izolatlar üzerinde sinerjistik etki gösterdiği ve time kill testi sonucunda da tüm izolatlara karşı 24 saat içinde bakterisidal aktivite sergilediği belirlendi. Bu çalışma, S. aureus izolatlarına karşı LEO&CHG kombinasyonlarının aktivitesini değerlendiren literatürdeki ilk çalışmadır. Bu bağlamda elde edilen in vitro bulgular doğrultusunda, in vivo çalışmaların tasarlanıp yürütülmesinin sonuçlara anlamlı katkı sağlaması ve klinik çalışmalar için de bir temel oluşturması beklenmektedir.
İnsan baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomlarında miR-363-3p ve miR-200c-3p'nin rollerinin belirlenmesi
Baş ve boyun kanserleri (BBK) en yaygın görülen altıncı malignitedir. Tanı ve tedavisinde önemli ilerlemeler olmasına rağmen, BBK'ler hala kansere bağlı önemli ölüm nedenlerinden biri olarak karşımıza çıkmaktadır. Tüm dünyada BBK'nin mortalite ve insidansının artacağı beklentisi yeni tedavi yaklaşımlarının gerekliliğini ortaya çıkarmıştır. Yeni tedavi yöntemlerinin gelişimini ön ayak olmak amacıyla da önemli biyolojik belirteçler keşfetmek bir zorunluluk haline gelmiştir. Bu tez kapsamında, miR-200c-3p/miR-363-3p'nin BBK patogenezindeki in vitro rollerinin daha iyi anlaşılması, olası yeni hedef genlerinin belirlenmesi ve bu hedef gen aracılığıyla kanser oluşum ve gelişim süreçlerindeki katkı mekanizmalarının aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, BBK tümör dokularında normal doku örneklerine göre miR-200c-3p ifadesinin azaldığı belirlenmesine karşın, miR-363-3p ifadesinin tümör örneklerinde normal doku örneklerine göre değişmediği tespit edildi. Bu nedenle, sonraki çalışmalarda miR-200c-3p'nin olası tümör süpresör potansiyeli araştırıldı. MiR-200c-3p'nin ektopik olarak arttırıldığı BBK hücrelerinde hücre canlılığı, hücre göçü, hücre invazyonu ve hücre apoptozu gibi kanser ilişkili fenotipler üzerindeki etkileri bir takım in vitro testlerle incelenerek ortaya çıkarıldı. Ayrıca, in siliko analizler yardımıyla aday hedef gen olarak belirlenen SSFA2'nin, ilk kez bu tez kapsamında miR-200c-3p'nin doğrudan hedefi olduğu lusiferaz raportör testi ile doğrulandı. Ek olarak, SSFA2'nin BBK patogenezinde onkogenik potansiyele sahip olduğu bir takım in vitro testlerle ortaya çıkarıldı. Ayrıca, SSFA2'nin taksol dirençli hücrelerde aşırı ifade edildiği ve SSFA2 ifade artışına paralel Ca2+ salınım kanalı olan IP3R1'in hücrelerde zamanla azaldığı ve BBK'de taksol direncinin ortaya çıkmasına neden olduğu ilk kez bu tez kapsamında ortaya konuldu. Elde ettiğimiz bu veriler, BBK gelişimi ve taksol direncinin oluşumunda miR-200c-3p/SSFA2/IP3R1 aksisinin rol aldığı ve BBK'lerde taksol direncinin üstesinden gelmek için SSFA2'nin terapötik olarak hedeflenebileceği ortaya çıkarıldı.
Tuz ve kuraklık koşulları altında fasulye genotiplerinde CHS gen ailesinin genom çaplı karakterizasyonu
Fasulye, sürdürülebilir tarım ve insan beslenmesine büyük katkı sağlayan bir üründür. Ancak, iklim değişikliği gibi faktörler, mevcut genetik çeşitliliğin artırılmasını ve yerel çeşitlerin özelliklerinin belirlenmesini gerektirir. Kuraklık, fasulye üretimini sınırlayan önemli bir abiyotik stres faktörüdür. Bu stresi azaltmak için çeşitli yöntemler uygulanırken, kalıcı ve temel bir çözüm, kuraklığa dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesidir. Bu tez çalışmasının amacı, fasulye genotiplerinde kuraklık ve tuz stresi altında CHS gen ailesi üyelerinin genom çaplı analizi, gen ifade seviyelerinin belirlenmesi ve karakterize edilmesidir. Bu çalışmada, farklı in siliko yöntemleri kullanılarak fasulye genomunda 14 CHS gen ailesi üyesi tespit edilmiştir. Bu genler 37,38 ila 43,34 kDa ağırlığında ve 341-393 arasında değişen aminoasit sayısına sahiptir. Pvul-CHS genleri arasındaki ekzon sayısı tüm genlerde 2 adettir. Phaseolus vulgaris, Arabidopsis thaliana ve Glycine max arasında yapılan filogenetik analizler, Pvul-CHS gen ailesinin 3 ana grupta kümelenmiş olduğunu göstermiştir. qRT-PCR analizleri sonucunda Pvul-CHS genlerinin kök ve yaprak dokularında ifade edildiğini ve bitkinin abiyotik streslere karşı farklı fizyolojik roller aldığını ortaya koymaktadır. Fasulye CHS gen ailesi üyelerinin kromozomal lokasyonları, akraba genomlarla olan ortolog ilişkileri ve cis-acting element analizleri in siliko olarak belirlenmiştir. Bu araştırmanın sonuçları, tuz ve kuraklık koşulları altında fasulye ıslahına yardımcı olabilir.
Fasulye (Phaseolus vurgaris L.) genotiplerinde kuraklık ve tuz stresi koşullarında melatonin uygulamasının epigenetik değerlendirilmesi
Fasulye yüksek protein, düşük yağ, yüksek oranda vitamin ve mineral içerdiği için insan beslenmesinde kullanılan önemli bir baklagil türüdür. Bitkiler yaşamları boyunca çeşitli biyotik ve abiyotik streslere maruz kalırlar ve streslere dayanıklılıkta çeşitli mekanizmalar geliştirmiştirler. Bu çalışmada kuraklık ve tuz stresi koşulları altında fasulye genotiplerine ekzojen olarak uygulanan melatoninin kök ve yaprak dokularında biyokimyasal ve epigenetik değişimlerine olan etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yedi gün boyunca çimlendirilen tohumlar daha sonra Hoagland çözeltisi içeren kaplarda 5 yapraklı döneme kadar yetiştirilmiş ve bu bitkilere 0 ve 200 μM melatonin püskürtme yöntemiyle yapraktan uygulanmıştır. 24 saat sonra farklı dozlarda tuz (0 ve 150 mM) ve PEG6000 (%0 ve %20) içeren Hoagland çözeltisine alınmıştır. Araştırmada biyokimyasal MDA ve H2O2, antioksidan enzim aktivitesi (SOD, POD ve CAT) ve DNA metilasyon değişimleri (CRED-iPBS) tespit edilmiştir. Araştırma sonucunda her iki genotip üzerinde uygulanan stresler MDA ve H2O2 miktarlarında artışa; tuz stresinde uygulanan melatonin ise bu parametrelerde azalışa neden olduğu belirlenmiştir. Genotiplerin SOD, POD ve CAT antioksidan aktiviteleri uygulamalara göre değişkenlik göstermiştir. Diğer taraftan DNA metilasyonu sonuçlarına göre hem stres koşulları hem de melatonin uygulaması DNA metilasyonlarında değişime neden olmuştur. Fasulyede tuz ve kuraklık stresi koşulları altında melatoninin bu etkisinin genomik ve transkriptomik seviyelerde belirlenmesi bu çalışmadaki bulguları destekler nitelikte olacaktır.
Soğuk stresi altındaki yonca (Medicago sativa L.) genotiplerinde salisilik asit ve magnezyum oksit nanopartikül uygulamalarının soğuk stresi toleransı ve mirna156, miRNA173 gen anlatım seviyelerine etkisinin incelenmesi
Bu çalışmanın amacı, yonca (Medicago sativa L.) genotiplerinin (Van/Denizli) soğuk stresine karşı tepkilerini değerlendirmek ve fidelere uygulanan eksojen salisilik asit (SA), magnezyum oksit nanopartikülü (MgO NPs) ile bunların kombinasyonunun (SA+MgO NPs) bu tepkiler üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu amaçla, 30 gün süreyle büyütülen yonca genotiplerinin yapraklarına eksojen olarak SA (1 ve 2 mM), MgO NPs (5 ve 20 ppm) ve SA+MgO NPs uygulanmış ve 14'er gün boyunca bitkiler sırasıyla 10 oC ve 4 oC soğuk stresine maruz bırakılmıştır. Yapılan uygulamaların soğuk hasarını yatıştırıcı etkilerini belirlemede, bazı biyokimyasal parametrelerin yanı sıra taramalı elektron mikroskop (SEM) görüntü analizi ve miRNA (miRNA156 ve miRNA173) gen anlatım seviyelerindeki değişiklikler incelenmiştir. Kontrol grubuna göre her iki düşük sıcaklık uygulaması total şeker, lipid peroksidasyonu (LPO), H2O2 ve prolin içeriklerini artırmıştır. Düşük sıcaklık koşullarında, tek başına SA ve MgO NPs uygulamaları LPO ve H2O2 içeriğinde belirgin bir düşüş ile prolin miktarında artış sağlarken, total şeker içeriğini etkilememiştir. Çalışılan her iki düşük sıcaklıkta soğuk stresin olumsuz etkilerini yatıştırma konusunda en etkili uygulama, 2 mM SA+20 ppm MgO NPs içeren yüksek konsantrasyonlu kombinasyon olmuştur. miRNA gen anlatım seviyeleri değerlendirildiğinde miR156, Van genotipinde 10 oC'de, Denizli ekotipi 10 oC / 4 oC koşullarında aşağı regüle olurken, Van genotipinde 4 oC'de yukarı regüle olmuştur. miR173, Van genotipinde 10 oC'de, Denizli ekotipi 10 oC / 4 oC'de yukarı regüle olurken, Van genotipinde 4 oC'de aşağı regüle olmuştur. 2 mM SA+20 ppm MgO NPs uygulaması her iki genotipin düşük sıcaklıklarında (10 / 4 oC) miR156 yukarı, miR173'ün aşağı regüle olmasına neden olmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, 2 mM SA+20 ppm MgO NPs kombinasyonunun, çalışılan yonca genotiplerinin düşük sıcaklıklara karşı gösterdiği bazı biyokimyasal ve gen düzeyindeki adaptasyon mekanizmalarını güçlendirdiğini ve soğuk stresine karşı etkili bir koruma sağladığını göstermektedir.
Pieris brassicae'den izole edilen serratia ficariabakterisine ait kitinaz proteinlerinin moleküler karakterizasyonu ve virulans etkisinin belirlenmesi
Brassicae familyasına ait sebzelerden biri olan lahana hem sağlık değerleri hem de ekonomik değeri bakımından oldukça önemlidir. Başlıca zararlısı olan Pieris brassica ile mücadele için günümüzde kimyasala alternatif yeni çözüm arayışı doğmuştur. Genomda böceklerin dış iskeletlerinin ve bağırsak epitel dokusunun parçalanmasına sebep olan kitinaz A, kitinaz B ve kitinaz D genleri bulunmasıyla Serratia ficaria potansiyel bir biyoinsektisit ajandır. Erzurum ilinde lahana ekili alalardan toplanan Pieris brassicae larvalarının aniden toplu olarak öldükleri gözlemlenmiştir. Enfeksiyon sebebini anlamak üzere 16S rRNA geninin yeni nesil dizilemesi yapılmıştır. Analiz sonucuda enfeksiyon nedeninin S. ficaria bakterisi olduğu anlaşılmıştır. Bu tez çalışmasında, yerel ve etkili S. ficaria entomopatojen izolatının kitinaz genleri Gibson klonlama yöntemiyle çoğaltılarak Kitinaz A, B ve D enzimlerinin üretimi ve saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Ardından P. brassicae larvalarına kitinaz enzimleri damlacık yedirme yöntemiyle uygulanarak larvalar enfekte edilmiştir. Ölüm oranları sırasıyla %100, %82 ve %90 olarak belirlenmiştir. En etkili enziminin Kitinaz A olduğu bulunmuştur. Kitinaz A enzimiyle yapılan doz denemesi sonucunda LD50 değeri 1095,31 ng/μl ve LT50 değeri 2,17 gün olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak S. ficaria'ya ait kitinaz enziminin P. brassicae ile mücadelede kullanılabilecek etkili bir potansiyel biyoinsektisit olduğu belirlenmiştir.