K vitamini ölçüm metodunun geliştirilmesi ve referans aralığının belirlenmesi

Vitaminler, yaşam için gerekli olan fizyolojik fonksiyonlarda önemli bir role sahip besin maddeleridir. Enerji sağlamanın yanı sıra yapısal görevlerde de işlev görmektedirler ve diğer besinlerden farklıdırlar. Vitaminler suda çözünen ve yağda çözünen olmak üzere iki gruba ayrılır. Bu gruba Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E ve Vitamin K dahildir. Vitamin K, özellikle bitkiler ve bakteriler tarafından üretilen, lipofilik bir vitamindir ve elektron taşıma ile enerji üretimi gibi temel fonksiyonlarda kullanılır. İnsanlar, protrombin üretimi, glutamik asit rezidülerinin posttranslasyonel modifikasyonu, kemik kalsifikasyonu, kalsiyum dengesi ve hücre döngüsü düzenlemesi gibi esansiyel metabolik süreçler için Vitamin K'ya ihtiyaç duyarlar. K vitamini üç ana alt tipe ayrılır: K1 (2-Methyl-3-phytyl-1,4-naphthoquinone), K2 (2-Methyl-3-multiprenyl-1,4-naphthoquinone) ve K3 (2-methyl-1,4-naphthoquinone). K1 vitamini, yeşil yapraklı bitkiler tarafından sentezlenirken, insanlarda ise kolonda bulunan gram pozitif bağırsak bakterileri tarafından üretilen K2 vitamini alt türleri olan menakinon (MK) adlı vitamin kullanılır. K2 vitamini alt türleri, izopren birimlerine göre adlandırılır ve en yaygın olarak MK6-10 arasında bulunur. K3 vitamini, menadion olarak da bilinir ve doğal olarak bulunmaz, suda çözünebilen bir takviye formudur. Vitamin K seviyesinin belirlenmesi, eksikliğine bağlı komplikasyonların tanısında büyük önem taşır. Bu doktora tez çalışmasında, standartlara uygun analitik performans özelliklerine sahip Vitamin K ve türevlerinin LC-MS/MS ölçüm yöntemi kullanılarak Türk toplumuna ait Vitamin K referans aralığının belirlenmesi amaçlanmaktadır. Aynı zamanda, katı faz ekstraksiyonu olmadan yüksek geri kazanım sağlayan yenilikçi bir ekstraksiyon yöntemi kullanılarak Vitamin K'nın ölçülmesi de hedeflenmektedir. Bu sayede, hastaların serum Vitamin K seviyelerinin belirlenmesi ve Vitamin K eksikliğine bağlı komplikasyonların tanısına katkı sağlanması amaçlanmaktadır. Metot kalibrasyonu için filokinon ve Vitamin K2 (MK-4) kimyasalları kullanılarak, 500 ng/mL'den 0.06 ng/mL yoğunluğa kadar standartlar hazırlandı. Bütün standartlar, metanol içinde çözüldü ve her bir kalibrasyon standartına, son yoğunluğu 10 ng/mL olacak şekilde internal standart eklendi. Karışım, vortex ve santrifüj işlemlerinden geçirildi. Üst faz alındı ve konsantratör cihazında uçuruldu. Kalıntı, 2-propanol, asetonitril ve metanol gibi kimyasallar kullanılarak serum numunelerine ait analitlerin hazırlığı yapıldı. Hazırlanan analitler, likit kromatografi yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi cihazında analiz edildi. Kütle spektrometresinde atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon yöntemi iyonizasyon kaynağı olarak kullanıldı. Kromatografik ayırma işlemi, 40 °C'de C18 - 100 x 2 mm - 3 µ boyutlu bir kolon kullanılarak gerçekleştirildi. Mobil faz olarak, su içinde %0.1 formik asit ve 3:1 (v/v) metanol/asetonitril karışımı kullanıldı. Geliştirilen yöntemin nihai validasyon çalışmaları, ölçüm sınırı, doğrusallık, gerçeklik, kesinlik ve sağlamlık testlerini içermektedir. Hazırlanan standartlar, 6 tekrarlı olarak analiz edildi ve kalibrasyon eğrisi oluşturuldu. Elde edilen veriler, regresyon analizi ile değerlendirildi. Türk toplumuna ait Vitamin K referans aralığını belirlemek için, içeri alma ve dışlama kriterlerini sağlayan 64 kadın ve 67 erkek sağlıklı kontrol grubu gönüllüsüne ait serum numuneleri kullanıldı. Bu numuneler, geliştirilen yöntemin nihai numune hazırlama prosedürüne uygun şekilde işlendi ve analiz edildi. Validasyon çalışmalarında istatistiksel analizler R programlama dili kullanılarak gerçekleştirildi. Spektrum analizleri ise açık kaynaklı MZmine 3 yazılımı üzerinde yapıldı. Referans aralık hesaplamaları ise Python programlama dili kullanılarak yapıldı. Vitamin K1 kalibrasyon standartı 6 kez tekrarlanarak çalışılmış ve elde edilen verilerle korelasyon katsayısı 0.9957 olarak hesaplanmıştır. Vitamin K, MK-4 ve MK-7 analitleri 10 kez tekrarlanarak çalışıldığında, yöntemin LOD (tayin sınırı) ve LOQ (ölçüm sınırı) değerleri sırasıyla 0.02 ng/mL ve 0.09 ng/mL olarak belirlenmiştir. Ortalama bağıl standart sapma ise %2.15 olarak hesaplanmıştır. Geri kazanım testleri sonuçlarına göre ise Vitamin K için %94, MK-4 için %88 ve MK-7 için %85 geri kazanım değerleri elde edilmiştir. Referans aralık çalışmaları için, dahil olma ve dışlama kriterlerine uygun olan 64 kadın ve 67 erkek sağlıklı kontrol grubu referans kitle olarak seçilmiştir. Sonuç olarak referans aralığı, 0.1-1.2 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Bu yöntem, en fazla 30 dakika içinde sonuç verebilme özelliğiyle birlikte ön hazırlık süresi ve ekstraksiyon aşamasında katı faz ekstraksiyon filtrelerine ihtiyaç duymadan diğer literatürdeki yöntemlerden pozitif şekilde ayrılmaktadır. Araştırma amacıyla laboratuvarlarda yöntem doğrulama çalışmaları yapıldıktan sonra kullanılmaya uygun hale gelir. Yöntemin karşılaştırma ve geçerli kılma çalışmaları yapıldıktan sonra rutin kullanıma geçilebilir. Vitamin K, MK-4 ve MK-7'nin referans aralığını belirlemek için Python programlama dilinde kod yazılmıştır. Bu kod, klinik laboratuvarlarda laboratuvar içi referans aralıklarını belirlemek amacıyla bütün parametreler için laboratuvar bilgi sistemlerine entegre edilebilir. Enzim destekli ekstraksiyon, diğer yağda çözünen vitaminlerin miktar tayinini yapmak için geliştirilecek yöntemlerde de kullanılabilir. Bu alanda yeni araştırma çalışmaları yapılabilir.