Kombine klostridial aşı üretiminde kullanılmak üzere C. perfringes beta, epsilon ve C. novyi alfa toksinlerini üreten rekombinant suş geliştirilmesi

Enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitis, küçükbaş hayvanlarda yüksek ölüm oranları ve ciddi ekonomik kayıplara yol açan, Clostridium türlerinin neden olduğu önemli bakteriyel hastalıklardır. Enterotoksemi, genellikle C. perfringens tip C ve D suşlarının toksinleriyle, enfeksiyöz nekrotik hepatit ise C. novyi tip B'nin toksinleriyle ilişkilidir. Bu hastalıkların kontrolünde geleneksel olarak aşılar ve hijyen/beslenme önlemleri kullanılmaktadır. Ancak klasik aşıların üretiminde yaşanan zorluklar, toksinlerin bağışıklık sistemini yeterince uyaramaması gibi sorunlar, daha etkili ve güvenli aşı stratejilerine olan ihtiyacı artırmıştır. Bu nedenle, rekombinant DNA teknolojisi ve sentetik biyoloji gibi modern yaklaşımlar, tanımlı antijenlerle yüksek verimli ve ölçeklenebilir aşı üretimine olanak sağlamaktadır. Bu tez kapsamında, enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitise karşı etkin bir aşı adayının geliştirilmesinde kullanılmak üzere rekombinant E. coli suşlarının tasarımı ve inşası gerçekleştirilmiştir. Hedef toksin genlerini taşıyan "pCpDetx, j23119-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpDetx, j23119-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, j23119-pelB-CnBtcn-alpha, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha" olmak üzere yedi farklı plazmid aracılı suş geliştirilmiştir. Bu plazmidler oluşturulurken ilave gen dizilerinin tasarıma eklenmesi ile daha yüksek seviyede protein ekspresyonu amaçlanmıştır. Ayrıca plazmidler, yüksek seviyede toksin üretimi sağlayabilecek konak sistemlerinde (ör. E. coli BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3)) test edilmiştir ve E. coli C43 (DE3) suşu yüksek protein ekspresyonu gözlemlenmiştir. Ayrıca CpDetx ve CpCcpb toksin genlerin plazmid aracılı inşalarının yanı sıra, bu genler hem ayrı ayrı hem de ikili olarak genoma entegrasyonları da başarılı bir şekilde tamamlanmıştır. Bu doğrultuda "E. coli cpb+, E. coli etx+ ve E. coli etx+ cpb+ " olarak adlandırılan genoma entegre suşlar elde edilmiştir. Üretilen rekombinant toksin proteinlerinin ekspresyon düzeyleri SDS-PAGE ile analiz edilmiş, bant yoğunlukları karşılaştırılarak en uygun plazmid ve konak kombinasyonu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, pET tabanlı ekspresyon plazmidini taşıyan (pET-28 (a)-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha) E. coli C43 (DE3) suşu, toksin genleri için yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlamıştır.